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基孔肯雅病毒理论与实验技术指南


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基孔肯雅病毒理论与实验技术指南
  • 书号：9787030739605
    作者：刘红旗
  • 外文书名：
  • 装帧：平装
    开本：B5
  • 页数：293
    字数：403000
    语种：zh-Hans
  • 出版社：科学出版社
    出版时间：2023-02-01
  • 所属分类：
  • 定价： ￥198.00元
    售价： ￥156.42元
  • 图书介质:
    纸质书

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本书为 Humana Press 出版的“分子生物学方法”（Methods in Molecular Biology）系列丛书之一，原书作者都是相关领域的专家，针对基孔肯雅病毒研究相关的实验技术方法，以标准操作规程（SOP）的体例，从基本概念、实验原理到具体操作步骤，进行了详尽描述。本书内容涵盖了临床和诊断病毒学、细胞和病毒培养实验技术及细胞应答研究中的生物信息学与蛋白质组学方法、免疫学和动物模型研究、抗病毒药物和疫苗研发。
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    第一部分　临床和诊断病毒学　
    第一章　基孔肯雅病毒进化和流行病学　3　
    1.1　引言　3　
    1.2　病毒的传播循环和媒介　3　
    1.3　病毒的历史和起源　4　
    1.4　2004年以来基孔肯雅病毒的流行病学和感染传播情况　5　
    1.5　基孔肯雅病毒在西半球的感染情况　6　
    1.6　结语　7　
    参考文献　7　
    第二章　基孔肯雅病毒分子流行病学　10　
    2.1　引言　10　
    2.2　材料　12　
    2.2.1　病毒RNA的提取　12　
    2.2.2　一步法反转录-聚合酶链反应（One-step RT-PCR）　12　
    2.2.3　聚合酶链反应（PCR）产物的琼脂糖凝胶电泳和纯化　13　
    2.2.4　测序反应　13　
    2.2.5　PCR测序产物的纯化　13　
    2.3 方法　14　
    2.3.1　病毒RNA的提取　14　
    2.3.2　一步法RT-PCR　14　
    2.3.3　琼脂糖凝胶电泳和纯化PCR产物　14　
    2.3.4　测序反应　15　
    2.3.5　纯化循环测序产物　15　
    2.3.6　测序数据编辑　16　
    2.3.7　系统发育树的构建　16　
    2.4　注释　16
    参考文献　17
    第三章　高级遗传方法学在基孔肯雅病毒进化和传播追踪溯源研究中的应用　19　
    3.1　引言　19　
    3.2　材料　20　
    3.3　方法　20　
    3.3.1　序列生成　21　
    3.3.2　从公共数据库获得序列　21　
    3.3.3　多序列比对　21　
    3.3.4　序列多态性和基因突变分析　22　
    3.3.5　中值连接进化网络的构建　23　
    3.3.6　生成一个时间尺度的贝叶斯系统发育树，并通过BEAST软件包计算目标序列到最近的共同祖先的时间（tMRCA）以确定祖先的年代　24　
    3.3.7　BEAST跟踪输出的可视化　26　
    3.3.8　用BEAST系统发育树输出方式构建最大分支可信度树　27　
    3.3.9　一致最大分支可信度树的可视化　27　
    3.3.10　通过BEAST2软件进行系统地理学分析来确定病毒株时空传播特点　27　
    3.3.11　用SPREAD软件使系统地理学输出可视化　29　
    3.4　注释　29
    参考文献　32
    第四章　基于合成肽的抗体检测方法诊断有无神经系统并发症的基孔肯雅病毒感染　34　
    4.1　引言　34　
    4.2　材料　35　
    4.2.1　单向电泳　35　
    4.2.2　双向电泳　36　
    4.2.3　电洗脱　37　
    4.2.4　液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析　37　
    4.2.5　多肽合成　37　
    4.2.6　酶联免疫吸附试验（ELISA）　38　
    4.3　方法　38　
    4.3.1　单向电泳　38　
    4.3.2　双向电泳　39　
    4.3.3　电洗脱　41　
    4.3.4　蛋白液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析　41　
    4.3.5　多肽合成41　
    4.3.6　酶联免疫吸附试验（ELISA）　42　
    4.4　注释　43
    参考文献　44
    第五章　E2糖蛋白在Sf9昆虫细胞的表达和纯化及其在血清学中的应用　45　
    5.1　引言　45　
    5.2　材料　46　
    5.2.1　昆虫表达组件的构建　47　
    5.2.2　Sf9细胞的维持及E2糖蛋白的瞬时表达　47　
    5.2.3　在昆虫细胞中稳定表达E2糖蛋白　47　
    5.2.4　稳定表达细胞的冻存　48　
    5.2.5　自然分泌CHIKV-E2的纯化　48　
    5.2.6　基孔肯雅病毒的血清学诊断　48　
    5.3　方法　48　
    5.3.1　构建昆虫表达组件　48　
    5.3.2　Sf9细胞的维持和E2糖蛋白的瞬时表达　49　
    5.3.3　E2糖蛋白在昆虫细胞中的稳定表达　50　
    5.3.4　稳定细胞的低温保存　51　
    5.3.5　纯化自然分泌的CHIKV-E2蛋白　51　
    5.3.6　CHIKV的血清学诊断　52　
    5.4　注释　53
    参考文献　54
    第六章　基于血清学工具的CHIKV感染诊断方法　55　
    6.1　引言　55　
    6.2　材料　60　
    6.3　方法　61　
    6.3.1　血清样品的准备　61　
    6.3.2　血清和病毒混合液的准备　62　
    6.3.3　细胞培养　62　
    6.3.4　用中和过的病毒感染细胞　62　
    6.3.5　计算结果　62　
    6.4　注释　62
    参考文献　63
    第七章　使用咽拭子及尿液标本诊断基孔肯雅病毒感染及其评价　65　
    7.1　引言　65　
    7.2　材料　66　
    7.2.1　病毒检测　66　
    7.2.2　ELISA检测IgM抗体　66　
    7.2.3　体外病毒分离　67　
    7.2.4　体内病毒分离　67　
    7.3　方法　67　
    7.3.1　通过分子生物学技术和测序分析检测病毒基因组　67　
    7.3.2　IgM抗体捕获-ELISA血清学检测　68　
    7.3.3　体外病毒分离　69　
    7.3.4　体内病毒分离　70　
    7.4　注释　70
    参考文献　71
    第二部分　细胞培养、病毒复制和细胞反应　
    第八章　用蚊子细胞扩增基孔肯雅病毒　75　
    8.1　引言　75　
    8.2　材料　76　
    8.2.1　培养C6/36细胞　76　
    8.2.2　病毒扩增　76　
    8.3　方法　76　
    8.3.1　培养C6/36细胞　76　
    8.3.2　病毒扩增　77　
    8.4　注释　78　
    参考文献　79
    第九章　基孔肯雅病毒感染的定量分析——病毒蚀斑试验　81　
    9.1　引言　81　
    9.2　材料　82　
    9.3　方法　83　
    9.3.1　收集用于蚀斑试验的样本　83　
    9.3.2　接种BHK-21细胞于24孔板　84　
    9.3.3　蚀斑试验　84　
    9.4　注释　86
    参考文献　88
    第十章　实时RT-PCR检测与定量分析基孔肯雅病毒　90　
    10.1　引言　90　
    10.2　材料　91　
    10.2.1　寡核苷酸序列　91　
    10.2.2　病毒RNA提取　91　
    10.2.3　常规RT-PCR　91　
    10.2.4　PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及纯化　92　
    10.2.5　体外转录合成cDNA　92　
    10.2.6　一步法SYBR Green I实时RT-PCR　92　
    10.2.7　一步法TaqMan实时RT-PCR　92　
    10.3　方法　92　
    10.3.1　病毒RNA提取　93　
    10.3.2　体外转录PCR产物的制备　93　
    10.3.3　琼脂糖凝胶电泳及PCR产物纯化　93　
    10.3.4　体外转录　94　
    10.3.5　RNA转录物的纯化　94　
    10.3.6　总RNA产量的计算　94　
    10.3.7　体外转录RNA拷贝数测定　95　
    10.3.8　用于RNA绝对定量的标准品构建　95　
    10.3.9　基于SYBR-Green I的实时RT-PCR的绝对定量　95　
    10.3.10　基于TaqMan的实时RT-PCR的绝对定量　97　
    10.3.11　定量未知样本中CHIKV载量　97　
    10.4　注释　98
    参考文献　100　
    第十一章　伊蚊的基孔肯雅病毒感染　102　
    11.1　引言　102　
    11.2　材料　103　
    11.2.1　含CHIKV的血液（CHIKV血饲）　103　
    11.2.2　蚊子感染　103　
    11.2.3　从蚊子收集CHIKV　104　
    11.2.4　处理采集的蚊子脏器　104　
    11.3　方法　104　
    11.3.1　准备含病毒的血食物　104　
    11.3.2　蚊子感染　105　
    11.3.3　采集和处理受感染蚊虫的脏器　106　
    11.3.4　处理采集的蚊虫组织器官　108　
    11.4　注释　108　
    参考文献　109　
    第十二章　人工血食物感染蚊虫中CHIKV的分析　111　
    12.1　引言　111　
    12.2　材料　112　
    12.2.1　蚊子的饲养　112　
    12.2.2　制备含感染性CHIKV的血食物　113　
    12.2.3　感染后蚊子的处理　113　
    12.2.4　核酸的检测与定量　114　
    12.3　方法　115　
    12.3.1　埃及伊蚊和白纹伊蚊群落的饲养　115　
    12.3.2　蚊子感染性血饲流程　116　
    12.3.3　暴露后蚊子处理：通过分析CPE检测蚊子中的病毒　117　
    12.3.4　暴露后蚊子处理：强迫唾液分泌　118　
    12.3.5　CHIKV核酸检测与定量　119　
    12.4　注释　119
    参考文献　121　
    第十三章　基孔肯雅病毒生长与荧光标记：免疫荧光法检测基孔肯雅病毒　122　
    13.1　引言　122　
    13.2　材料　123　
    13.2.1　病毒生长　123　
    13.2.2　荧光显微镜　123　
    13.2.3　使用IFA进行血清学诊断　124　
    13.2.4　流式细胞术　124　
    13.3　方法　125　
    13.3.1　细胞生长　125　
    13.3.2　荧光显微镜下确定病毒的生长　125　
    13.3.3　应用IFA进行血清学诊断　126　
    13.3.4　流式细胞术测定病毒生长　127　
    13.4　注释　127　
    参考文献　128　
    第十四章　用蔗糖密度梯度分离和制备基孔肯雅病毒样本用于透射电镜观察　130　
    14.1　引言　130　
    14.2　材料　131　
    14.2.1　CHIKV的分离与扩增　131　
    14.2.2　病毒纯化　131　
    14.2.3　负染色和免疫金标记法　132　
    14.3　方法　132　
    14.3.1　分离CHIKV　132　
    14.3.2　CHIKV滴定　133　
    14.3.3　大规模扩增CHIKV用于病毒纯化　134　
    14.3.4　聚乙二醇（PEG沉淀）纯化病毒　134　
    14.3.5　不连续的蔗糖梯度纯化病毒　135　
    14.3.6　负染法　136　
    14.3.7　免疫胶体金标记　136　
    14.4　注释　137　
    参考文献　138　
    第十五章　酵母双杂交筛选法研究病毒-宿主蛋白的相互作用　139　
    15.1　引言　139　
    15.2　材料　141　
    15.2.1　GAL4 Y2H系统中使用的酵母菌株和质粒　141　
    15.2.2　培养基　141　
    15.2.3　酵母转化　142　
    15.2.4　准备酵母蛋白提取物　143　
    15.2.5　BD病毒融合构建物自激活的检测　144　
    15.2.6　病毒-宿主相互作用文库的筛选　144　
    15.2.7　酵母菌落PCR　144　
    15.2.8　多重库质粒的排除　145　
    15.2.9　限制性消化排除重复文库质粒　145　
    15.2.10　从酵母中分离捕获质粒DNA　145　
    15.2.11　大肠杆菌细胞中酵母质粒的转化　145　
    15.2.12　细菌菌落PCR　145　
    15.2.13　分离大肠杆菌DH5α细胞中的质粒DNA　146　
    15.3　方法　146　
    15.3.1　酵母细胞的小量转化　146　
    15.3.2　准备酵母蛋白提取物　146　
    15.3.3　自激活分析　148　
    15.3.4　酵母双杂交文库筛选　148　
    15.3.5　酵母菌落PCR　149　
    15.3.6　消除多重库质粒　150　
    15.3.7　限制性酶切消除重复文库质粒　150　
    15.3.8　从酵母中分离捕获质粒DNA　150　
    15.3.9　酵母质粒转化大肠杆菌（DH5α）　150　
    15.3.10　细菌克隆PCR和质粒DNA分离　151　
    15.3.11　测序分析　151　
    15.4　注释　151　
    参考文献　153　
    第十六章　GelC-MS/MS在基孔肯雅病毒感染蛋白质组分析中的应用：制备用于分析的肽段　155　
    16.1　引言　155　
    16.2　材料　156　
    16.2.1　蛋白制备及定量　156　
    16.2.2　SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）　157　
    16.2.3　凝胶染色和脱色（考马斯亮蓝）　158　
    16.2.4　凝胶染色和脱色（银染）　158　
    16.2.5　凝胶处理　159　
    16.2.6　蛋白分析　160　
    16.3　方法　160　
    16.3.1　样品制备（在组织培养板或培养瓶中培养的细胞）　160　
    16.3.2　标本制备（临床材料：白细胞）　161　
    16.3.3　Lowry法测定蛋白浓度　161　
    16.3.4　十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）　161　
    16.3.5　凝胶染色和脱色（考马斯亮蓝）　162　
    16.3.6　凝胶染色和脱色（银染）　162　
    16.3.7　还原/烷基化和凝胶内酶切消化　163　
    16.4　注释　165　
    参考文献　166　
    第十七章　生物信息学方法研究基孔肯雅病毒感染过程中病毒与宿主的相互作用　167　
    17.1　引言　167　
    17.2　方法　168　
    17.2.1　病毒蛋白结构　168　
    17.2.2　鉴定基孔肯雅病毒和宿主的结构相似蛋白　168　
    17.2.3　CHIKV与宿主蛋白相互作用的预测　168　
    17.2.4　基因聚类与相互验证　169　
    17.2.5　结果解释　170　
    17.3　注释　170　
    参考文献　170　
    第十八章　基孔肯雅病毒T细胞表位预测　173　
    18.1　引言　173　
    18.2　材料　174　
    18.2.1　数据　174　
    18.2.2　软件　174　
    18.3　方法　174　
    18.3.1　结合物和非结合物的定义　174　
    18.3.2　肽序列转化为特征性载体　174　
    18.3.3　预测模型的建立　175　
    18.3.4　预测模型的评价　176　
    18.3.5　CHIKV T细胞表位的预测　177　
    18.4　注释　178　
    参考文献　178　
    第三部分　免疫学和动物模型研究
    第十九章　基孔肯雅病毒小鼠模型　183　
    19.1　引言　183　
    19.2　材料　184　
    19.2.1　新生小鼠的脑内感染　184　
    19.2.2　3周龄到成年小鼠鼻内接种感染CHIKV　184　
    19.2.3　新生小鼠的皮下接种　185　
    19.2.4　14天到成年C57BL/6小鼠的足部皮下接种感染　185　
    19.3　方法　185　
    19.3.1　新生小鼠的脑内感染　186　
    19.3.2　CHIKV鼻内感染3周龄到成年小鼠　187　
    19.3.3　CHIKV皮下接种新生小鼠　188　
    19.3.4　后肢皮下感染2周龄至成年C57BL/6小鼠　189　
    19.4　注释　191　
    参考文献　193　
    第二十章　使用ClonaCell-HY杂交瘤克隆试剂盒制备基孔肯雅病毒小鼠特异性单克隆抗体　195　
    20.1　引言　195　
    20.2　材料　196　
    20.2.1　生物材料、细胞培养基和试剂　196　
    20.2.2　其余设备和物品　196　
    20.3　方法　197　
    20.3.1　用基孔肯雅病毒免疫接种小鼠　197　
    20.3.2　SP2/0骨髓瘤细胞制备　197　
    20.3.3　小鼠脾细胞制备　197　
    20.3.4　融合　198　
    20.3.5　融合细胞接种培养皿　198　
    20.3.6　挑选克隆　199　
    20.3.7　克隆和亚克隆筛选　199　
    20.4　注释　201　
    参考文献　201　
    第二十一章　免疫组化检测福尔马林固定和石蜡包埋组织中基孔肯雅病毒抗原　203　
    21.1　引言　203　
    21.2　材料　204　
    21.2.1　石蜡切片　204　
    21.2.2　免疫组化　204　
    21.3　方法　204　
    21.3.1　石蜡切片　204　
    21.3.2　免疫组化　205　
    21.4　注释　206　
    参考文献　207　
    第四部分　抗病毒药物和疫苗　
    第二十二章　抗基孔肯雅病毒的抗病毒策略　211　
    22.1　引言　211　
    22.2　治疗CHIKV感染的抗病毒策略　212　
    22.2.1　病毒侵入抑制剂　212　
    22.2.2　病毒蛋白翻译抑制剂　213　
    22.2.3　病毒基因组复制抑制剂　214　
    22.2.4　CHIKV nsP2抑制剂　215　
    22.2.5　宿主靶点抑制剂　215　
    22.2.6　未知靶点的抑制剂　217　
    22.3　结论　218　
    参考文献　218　
    第二十三章　实时细胞分析鉴定基孔肯雅病毒的新型抗病毒化合物　222　
    23.1　引言　222　
    23.2　材料　223　
    23.2.1　组织培养　223　
    23.2.2　细胞　223　
    23.2.3　病毒　224　
    23.2.4　抗病毒化合物　224　
    23.2.5　RTCA组件　224　
    23.3　方法　224　
    23.3.1　细胞增殖分析　224　
    23.3.2　细胞毒性试验　225　
    23.3.3　抗病毒试验　225　
    23.4　注释　227　
    参考文献　228　
    第二十四章　双顺反子杆状病毒表达载体系统筛选干扰基孔肯雅病毒感染的化合物　229　
    24.1　引言　229　
    24.2　材料　230　
    24.2.1　昆虫细胞培养　230　
    24.2.2　重组杆状病毒产生与纯化　230　
    24.2.3　昆虫细胞融合抑制试验　231　
    24.2.4　化合物体外抗CHIKV活性测定　232　
    24.3　方法　232　
    24.3.1　昆虫细胞培养　232　
    24.3.2　在Sf21细胞中产生重组杆状病毒　232　
    24.3.3　重组杆状病毒的纯化　233　
    24.3.4　昆虫细胞融合抑制试验　234　
    24.3.5　体外抗CHIKV活性测定　235　
    24.4　注释　236　
    参考文献　237　
    第二十五章　基孔肯雅病毒感染中和试验：蚀斑减少中和试验　239　
    25.1　引言　239　
    25.2　材料　240　
    25.3　方法　241　
    25.3.1　在12孔板准备细胞单层　241　
    25.3.2　CHIKV-抗体免疫复合物的制备　242　
    25.3.3　感染检测　242　
    25.3.4　蚀斑可视化　244　
    25.3.5　蚀斑减少中和效价的测定　244　
    25.3.6　微量中和试验　245　
    25.4　注释　245　
    参考文献　246　
    第二十六章　CHIKV反向遗传学研究方法　248　
    26.1　引言　248　
    26.2　材料　250　
    26.2.1　病毒RNA提取　250　
    26.2.2　反转录　250　
    26.2.3　PCR扩增　250　
    26.2.4　琼脂糖凝胶电泳和胶回收　250　
    26.2.5　DNA克隆　250　
    26.2.6　RNA转录与加帽　251　
    26.2.7　克隆衍生CHIKV复制与扩增　251　
    26.2.8　定点突变　251　
    26.3　方法　252　
    26.3.1　病毒RNA提取与cDNA合成　252　
    26.3.2　PCR扩增病毒cDNA片段　252　
    26.3.3　将病毒cDNA克隆至质粒载体　253　
    26.3.4　CHIKV RNA转录本合成　255　
    26.3.5　通过RNA转染获得感染性克隆来源的CHIKV　255　
    26.3.6　克隆来源的CHIKV扩增与特性研究　256　
    26.3.7　通过定点突变技术将突变引入全长cDNA克隆　256　
    26.4　注释　257　
    参考文献　258　
    第二十七章　在昆虫细胞中制备基孔肯雅病毒样颗粒和亚单位疫苗　260　
    27.1　引言　260　
    27.2　材料　261　
    27.2.1　细胞培养　261　
    27.2.2　重组杆状病毒Ac-sE1、Ac-sE2和Ac-S27制备　261　
    27.2.3　CHIKV-sE1和-sE2糖蛋白亚单位及VLP制备　263　
    27.2.4　CHIKV-sE1和-sE2糖蛋白亚单位纯化　263　
    27.2.5　CHIKV-VLP纯化　263　
    27.2.6　CHIKV糖蛋白分析　263　
    27.3　方法　264　
    27.3.1　细胞培养　264　
    27.3.2　重组杆状病毒Ac-sE1、Ac-sE2和Ac-S27制备　264　
    27.3.3　CHIKV-sE1和-sE2亚单位及VLP制备　267　
    27.3.4　sE1和sE2亚单位纯化　267　
    27.3.5　CHIKV-VLP纯化　268　
    27.3.6　CHIKV蛋白分析　268　
    27.4　注释　269　
    参考文献　271　
    第二十八章　基孔肯雅病毒DNA新型疫苗的研发程序　273　
    28.1　引言　273　
    28.2　材料　276　
    28.2.1　体外转染　276　
    28.2.2　SDS-PAGE和Western blotting　277　
    28.2.3　免疫荧光分析　277　
    28.2.4　DNA疫苗免疫小鼠　278　
    28.2.5　免疫小鼠脾细胞分离　278　
    28.2.6　IFN-γ酶联免疫斑点试验　278　
    28.2.7　酶联免疫吸附试验（ELISA）　279　
    28.2.8　流式细胞术和细胞内细胞因子染色试验　279　
    28.2.9　病毒中和试验　280　
    28.2.10　猕猴DNA质粒免疫研究　280　
    28.3　方法　280　
    28.3　DNA疫苗设计　280　
    28.3　体外转染　281　
    28.3　SDS-PAGE和　Western blotting　282　
    28.3　免疫荧光分析（IFA）　282　
    28.3　DNA疫苗免疫小鼠　283　
    28.3　免疫小鼠脾细胞分离　283　
    28.3　IFN-γ酶联免疫斑点试验　284　
    28.3　ELISA结合实验　284　
    28.3　流式细胞术（FACS）和细胞内细胞因子染色（ICS）分析　285　
    28.3　病毒中和试验　286　
    28.3　恒河猴DNA质粒免疫研究　286　
    28.4　注释　287　
    参考文献　289　
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