本书着重介绍国际上近年发展起来的分子生物学及生物技术方面的新技术、新方法，突出一个“新”字。书中大部分章节是目前国际上的研究热点。如：DNA与蛋白质相互关系、抗体工程、噬体表面显示技术、蛋白质与蛋白质相互关系等。本书对一些有过介绍的，如基因文库构建及筛选，聚合酶链反应(PCR)、DNA测序、基因表达等一些基本实验方法也做了叙述。使本书成为一本较为全面的介绍分子生物学最新实验方法的参考书。因此本书即是一本实用性极强的介绍新技术、新方法的实验手册。也是一本统揽当今分子生物学新理论、新进展的参考书。
本书可供分子生物学、生物化学、生物技术、医药卫生以及农、林、牧等方面有关的科研、教学与技术人员参考之用。
样章试读
目录
- 序
前言
第1章 DNA与蛋白质相互关系
1.1细胞核蛋白质的提取
1.1.1细胞核蛋白质的提取
1.1.2细胞核提取物的快速制备法
1.2凝胶滞后实验
1.2.1凝胶滞后实验
1.2.2超级凝胶电泳
1.3干扰实验
1.3.1甲基化干扰实验
1.3.2尿嘧啶干扰实验
1.4脱氧核糖核酸酶Ⅰ足迹分析
1.5随机PCR
1.5.1寡核苷酸的设计与合成
1.5.2寡核苷酸的纯化
1.5.3探针标记
1.5.4凝胶滞后实验纯化探针
1.5.5特异结合序列的克隆与序列分析1.6核酸-蛋白质杂交实验
1.6.1电泳及电转移
1.6.2标记探针
1.6.3蛋白质变性、复性
1.6.4杂交及放射自显影
参考文献
第2章 cDNA文库构建及目的基因的筛选
2.1cDNA第一条链的合成
2.1.1cDNA第一条链合成的策略
2.1.2cDNA第一条链合成的操作步骤
2.2cDNA第二条链的合成
2.2.1置换合成法
2.2.2PCR法
2.3cDNA克隆的其他策略
2.3.1加尾载体作引物引导cDNA合成——定向克隆
2.3.2Okayama-Berg克隆法——定向克隆
2.3.3末端加尾直接克隆——非定向克隆
2.3.4加接头直接克隆——非定向克隆（双链cDNA末端无酶切位点）
2.3.5加接头克隆——定向克隆（双链cDNA一端带酶切位点）
2.3.6加连接于克隆——非定向克隆（双链cDNA末端无酶切位点）
2.3.7加连接子克隆——定向克隆（双链cDNA一个末端带有酶切位点）
2.3.8PCR产物的直接克隆——非定向克隆
2.3.9PCR产物的黏瑞克隆法——定向克隆（两个PCR引物均带酶切位点）
2.3.10无连接酶克隆法
2.4重组子的筛选与鉴定
2.4.1根据遗传表型筛选
2.4.2分析重组子结构特征的筛选法
2.5构建cDNA文库新方法
2.5.1减数cDNA文库
2.5.2标准化cDNA文库
2.6mRNA差示显示技术
2.6.1基本原理和方法
2.6.2优化反应条件
2.6.3差异显示技术在生物医学中的应用
2.6.4差异显示技术存在的问题及改良措施
2.6.5差异显示技术与相关方法的比较
2.6.6差异显示技术的展望
2.7人类基因组计划及后基因组计划
2.7.1物理图谱的制作
2.7.2测序及寻找新的功能因子
2.7.3人类后基因组计划
参考文献
第3章 抗体工程
3.1基因工程抗体的免疫学基础
3.1.1免疫应答
3.1.2抗体的分子结构和功能
3.1.3抗体基因的DNA重排
3.1.4抗体库的产生
3.1.5抗原抗体的结合
3.2噬菌体表面表达技术与噬菌体抗体
3.2.1表达Fab段抗体的pComb3载体系统
3.2.2表达scFv单链抗体pHEN1和pCANTAB5E的载体系统
3.2.3抗体基因在大肠杆菌中的转录和翻译
3.2.4Fab抗体或scFv抗体在细胞膜间隙的组装
3.2.5用于噬菌体抗体表达系统的大肠杆菌菌株
3.3基因工程重组抗体——Fab抗体
3.3.1淋巴细胞的分离纯化
3.3.2总细胞RNA的提取
3.3.3cDNA的合成
3.3.4PCR扩增Fab抗体基因
3.3.5PCR产物的纯化
3.3.6Fd和轻链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立
3.3.7噬菌体抗体库的富集筛选
3.3.8噬菌体抗体库的菌落筛选法
3.3.9Fab抗体在原核细胞中的可溶性表达
3.3.10电转感受态菌XIL－Blu的制备
3.3.11电转感受态菌TG1的制备
3.3.12辅助噬菌体毒种制备
3.3.13噬菌体毒种的滴定
3.4基因工程重组抗体——单链抗体scFv
3.4.1淋巴细胞的分离纯化
3.4.2总细胞RNA的提取和cDNA的合成
3.4.3PCR扩增抗体可变区基因及scFV单链抗体基因
3.4.4Linker连接片段的制备
3.4.5人单链Fv（scFv）片段的组装
3.4.6scFv单链噬菌体抗体库的构建
3.4.7单链噬菌体抗体库的富集筛选
3.4.8scFv单链抗体融合表达和可溶性表达
3.5Fab段抗体和scFv单链抗体表达产物的纯化和鉴定
3.5.1抗Fab抗体亲和层析纯化法
3.5.2Protein A-Sepharose柱层析纯化
3.5.3金属离子亲和层析柱纯化
3.5.4Fab抗体或scFV抗体的特异性鉴定
3.5.5重组抗体可变区基因序列测定及分析
3.6重组抗体全免疫球蛋白基因的表达
3.6.1可变区基因与恒定区基因的连接——全抗体基因在哺乳类细胞中的表达
3.6.2全IgG抗体基因的表达系统——重组杆状病毒系统
参考文献
第4章 丝状噬菌体表面显示技术的基本原理和应用
4.1概述4.1.1丝状噬菌体的基本特征
4.1.2噬菌体显示的基本原理和优势
4.1.3噬菌体显示技术的发展和意义
4.1.4噬菌体显示的基本策略
4.2噬菌体随机多肽文库
4.2.1概述
4.2.2构建噬菌体肽库的操作步骤
4.3噬菌体在cDNA文库表达和筛选中的应用
4.3.1pJuFo载体的概述
4.3.2pJufo载体应用举例
4.3.3pJuFo系统的筛选
4.3.4pJuFo系统的应用
4.3.5pJuFo系统优势和限制因素
4.4噬菌体在蛋白质改造中的应用
4.4.1选择突变蛋白质的一般原则
4.4.2实验设计的一般步骤和程序
4.5影响噬菌体筛选效率的因素
4.5.1表达水平对筛选效率的影响
4.5.2亲和力对筛选效率的影响
4.6噬菌体表面显示技术相关的信息资源
4.6.1噬菌体肽库和抗体库
4.6.2抗噬菌体抗体
4.6.3如何分析筛选结果
4.6.4分子文库的www网址
参考文献
第5章 聚合酶链反应
5.1基本PCR技术
5.1.1基本步骤
5.1.2实验条件的优化
5.2RT－PCR
5.2.1基本步骤
5.2.2简化步骤
5.2.3影响因素
5.3单侧（锚式）PCR
5.3.1扩增已知序列的下游片段
5.3.2扩增已知序列的上游片段
5.3.3注意事项
5.4差异显示PCR
5.4.1实验步骤
5.4.2注意事项
5.5免疫PCR
5.5.1实验步骤
5.5.2注意事项
5.6PCR－ELISA
5.6.1实验步骤
5.6.2注意事项
参考文献
第6章 实用DNA突变技术
6.1无表型选择的寡核苷酸介导的突变
6.1.1突变原理
6.1.2实验操作步骤
6.1.3注意事项
6.2简并寡核苷酸诱变
6.2.1突变原理
6.2.2实验操作步骤
6.2.3注意事项
6.3基因人工合成
6.3.1突变原理
6.3.2实验操作步骤
6.3.3注意事项
6.4区域特异性突变
6.4.1突变原理
6.4.2实验操作步骤
6.4.3注意事项
6.5DNA的接头分区突变
6.5.1突变原理
6.5.2使用巢式缺失的互补寡核苷酸的接头分区突变(基本方案)
6.5.3使用寡核苷酸定位的接头分区突变（替代方案）
6.5.4注意事项
6.6PCR介导的突变
6.6.1通过PCR方法引入限制性酶切位点原理（基本方案1）
6.6.2实验操作步骤
6.6.3通过PCR方法引入点突变原理（基本方案2）
6.6.4实验操作步骤
6.6.5通过连续PCR引入点突变原理（替代方案）
6.6.6实验操作步骤
6.6.7注意事项
参考文献
第7章 外源基因在哺乳动物细胞中的表达
7.1外源基因导入哺乳动物细胞中的技术方法
7.1.1磷酸钙沉淀转染法
7.1.2DEAE-葡聚糖转染法
7.1.3脂质体介导的转染
7.1.4电穿孔转染法
7.1.5基因枪粒子轰击法
7.1.6受体介导的基因导入法
7.2病毒载体介导的基因转移
7.2.1通过反转录病毒系统表达外源基因的原理
7.2.2建立特异的产反转录病毒细胞系（基本方法）
7.2.3通过腺病毒载体系统表达外源基因
7.3报告基因的表达及检测
7.3.1半乳糖苷酶基因
7.3.2下氯霉素乙酸转移酶基因
7.3.3荧光素酶基因
7.3.4绿色荧光蛋白基因
7.3.5人生长激素基因
7.3.6分泌型的碱性磷酸酶基因
7.3.7β-葡萄糖醛酸酶基因
7.4外源基因的稳定表达
7.4.1保留稳定转化细胞系的常用选择标记
7.4.2分离稳定转化细胞系的基本步骤（基本方法）
参考文献
第8章 DNA序列测定
8.1DNA测序方法概述
8.1.1DNA测序方法的分类
8.1.2DNA测序的策略
8.1.3双脱氧测序法和化学测序法的选择
8.1.4DNA测序技术的进展
8.2构建DNA测序用的嵌套缺失
8.2.1用外切酶Ⅲ（ExoⅢ）构建单一方向的缺失（基本操作）
8.2.2用[α-35S]dNTPs保护DNA使其免受外切酶Ⅲ（ExoⅢ）的消化
8.2.3用Bal31核酸酶构建嵌套缺失（基本操作）
8.2.4制备M13mp测序载体来亚克隆Bal31消化的DNA片段
8.2.5注释
8.3DNA序列测定模板的制备
8.3.1单链M13噬菌体DNA的制备
8.3.2从小量细胞裂解液中制备λDNA模板
8.3.3化学测序所需重组Psp64CS或pSP65CS质粒DNA的微量制备
8.3.4双脱氧法测序所需双链质粒DNA的微量制备
8.3.5双脱氧法测序所需双链质粒DNA的碱变性
8.3.6从一个大肠杆菌菌落中制备质粒DNA或从一个噬菌斑中制备噬菌体DNA用于热循环测序
8.3.7注释
8.4DNA双脱氧测序法
8.4.1用测序酶（Sequenase）来标记／终止测序反应（基本操作）
8.4.2在标记／终止反应中使用Mn2+离子（替代操作1）
8.4.3在标记／终止测序反应中使用其他DNA聚合酶（替代操作2）
8.4.4用Klenow片段进行Sanger法测序（基本操作）
8.4.5利用Taq DNA聚合酶进行Sanger反应（替代操作）
8.4.6利用5'末端标记引物进行一步法测序（替代操作2）
8.4.7利用同位素标记核苷酸进行热循环测序反应（基本操作）
8.4.8利用5'端引物标记进行热循环测序反应（替代操作）
8.4.9注释
8.5用化学发光检测法进行DNA双脱氧测序
8.5.1用生物素化引物进行化学发光检测的DNA测序（基本操作）
8.5.2用链霉抗生物素蛋白和生物素化碱性磷酸酶进行两步（间接）检测（替代操作1）
8.5.3用半抗原标记引物进行测序，用抗体-碱性磷酸酶偶联物进行检测（替代操作2）
8.5.4注释
8.6化学法测定DNA序列
8.6.1策略设计
8.6.2用32P标记DNA的化学测序（基本操作）
8.6.3Tth111I消化和末端标记（替代操作）
8.6.4注释
8.7变性凝胶测定电泳
8.7.1灌胶、电泳和测序凝胶的处理（基本操作）
8.7.2缓冲液梯度测序凝胶（替代操作1）
8.7.3电解质梯度测序凝胶（替代操作2）
8.7.4含甲酰胺的测序凝胶（替代操作3）
8.7.5注释
参考文献
第9章 蛋白质的表达
9.1外源基因在原核细胞中的表达
9.1.1蛋白质在原核细胞中的表达特点
9.1.2蛋白质在原核细胞表达的调控
9.1.3蛋白质在原核细胞中的表达形式
9.1.4T7启动子的原核表达系统
9.1.5利用pET载体在大肠杆菌中表达外源基因的基本操作
9.2外源基因在哺乳动物细胞内的表达
9.2.1病毒介导的基因表达
9.2.2重组痘苗病毒共表达汉坦病毒M和S片断的操作步骤
9.2.3外源基因在哺乳动物细胞中的瞬时表达
9.2.4痘菌病毒瞬时表达T7 RNA聚合酶的操作步骤
9.2.5外源基因在哺乳动物细胞系中的稳定表达
9.2.6哺乳动物细胞系稳定表达汉坦病毒S片断的操作步骤
9.3外源基因在杆状病毒系统的表达
9.3.1杆状病毒系统表达外源基因的特点和策略
9.3.2杆状病毒表达汉坦病毒M片断的操作步骤
9.4重组蛋白的检测和鉴定
9.4.1免疫荧光（IFA）的原理和基本操作
9.4.2酶联免疫吸附试验
9.4.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本操作
9.4.4蛋白印迹试验的基本操作
9.4.5放射免疫沉淀的原理和基本操作
参考文献
第10章 蛋白质与蛋白质相互作用的研究策略
10.1蛋白质间相互作用的形式和作用力
10.1.1蛋白质间相互作用的形式
10.1.2蛋白质之间相互作用的作用力
10.2蛋白质间相互作用的研究策略
10.2.1蛋白质配体结合结构域的筛选10.2.2蛋白质配体的筛选
10.3酵母双杂交系统的操作程序
10.3.1酵母双杂交系统操作的基本流程
10.3.2实验材料
10.3.3基本实验方法
10.4注释
参考文献
第11章 生物芯片技术
11.1生物芯片技术的发展
11.2生物芯片的类型
11.2.1基因芯片
11.2.2蛋白芯片
11.2.3缩微芯片
11.3生物芯片应用的大致操作流程
11.3.1探针的设计、合成与芯片的制作
11.3.2靶基因样品的制备
11.3.3杂交
11.3.4杂交信号的检测与结果的分析
11.4生物芯片应用的具体操作方法
11.4.1cDNA微点阵
11.4.2寡核苷酸微点阵
11.5生物芯片技术的应用
11.5.1利用DNA芯片进行DNA序列的测定
11.5.2利用芯片技术进行基因突变的检测
11.5.3用于基因转录水平的监测、基因组分析和后基因组研究
11.6前景与展望
参考文献
第12章 生物信息学
12.1概述
12.2生物信息数据库与查询
12.2.1基因和基因组数据库
12.2.2蛋白质数据库
12.2.3功能数据库
12.2.4其他数据库资源
12.3序列比对和数据库搜索
12.3.1序列两两比对
12.3.2多序列比对
12.4核酸与蛋白质结构和功能的预测分析
12.4.1针对核酸序列的预测方法
12.4.2针对蛋白质的预测方法
12.5分子进化
12.5.1分子进化钟与中性理论
12.5.2进化树
12.6基因组序列信息分析
12.6.1基因组序列分析工具
12.6.2人类和鼠类公共物理图谱数据库的使用
12.6.3基因组比较
12.6.4SNP预测
12.7功能基因组相关信息分析
12.7.1大规模基因表达谱分析
12.7.2基因组水平蛋白质功能综合预测
参考文献
附录1 实验室细胞培养的若干问题
附录2 常用溶液与配制
京公网安备 11010102004214号