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本书是一本集现代分子生物学最新技术的基本原理和操作方法之大成的工具书。所收入的全是十分常用的重要方法，涉及17方面的内容：大肠杆菌、质粒和噬菌体，DNA制备与分析，DNA和RNA的酶促操作，RNA的制备与纯化，重组DNA文库，重组DNA文库的筛选，DNA测序，重组DNA诱变，DNA转染哺乳动物细胞方法的介绍，蛋白质分析，免疫学，DNA-蛋白质相互作用，酿酒酵母，原位杂交与免疫组织化学，聚合酶链式反应，蛋白质表达，蛋白质磷酸化分析等。本书内容新颖、丰富、实用，适用于从事生物、医“学和其他与生命科学相关的基础和应用研究的科研或教学人员。
目录
- 中译本序
前言
第1章大肠杆菌、质粒和噬菌体
1．l培养基及细菌学常用工具的准备
1．1．1极限培养基
1．1．2丰富培养基
l．1．3固体培养基
l．1．4顶层琼脂培养基
1．1．5穿刺琼脂培养基
1．l．6实验工具
1．2在液体培养基中培养
1．2．1基本方案1过夜培养
l．2．2基本方案2大体积培养
1．2．3基本方案3细菌培养的监测
1．3在固体培养基中培养
1．3．1基本方案1通过连续稀释法滴定和分离细菌菌落
1．3．2基本方法2通过平板划线法分离单菌落
l．3．3基本方案3通过铺平板分离单个菌落
1．3．4辅助方案1影印平板
1．3．5辅助方案2菌株的保存和复苏
1．4经典细菌遗传学选论
1．5质粒图谱
1．6质粒DNA的小量制备
1．6．1基本方案1碱裂解小量制备法
1．6．2备择方案96孔微量滴定板碱裂解法
1．6．3基本方案2煮沸小皇制备法
1．6．4辅助方案质粒DNA的保存
1．7质粒DNA的大量制备
1．7．1粗制裂解物的制备
基本方案1碱裂解法
基本方案2氯化铯／澳化乙锭平衡离心法
1．7．2备择方案利用离子交换层析和分子筛层析纯化质粒DNA
1．8将质粒DNA导入细菌细胞
1．8．1基本方案ICaCl2转化法
1．8．2备择方案一步法制备和转化感受态细菌
1．8．3基本方案2高效率的电转化方法
1．9源于丝状噬菌体的载体
1．9．l丝状噬菌体载体的发展和应用
1．9．1噬菌体衍生载体的制备和应用
基本方案利用辅助噬菌体从质粒制备单链DNA
第2章DNA的制备和分析
2．l水溶液中DNA的纯化和浓缩
2．1．1基本方案DNA的酚抽提和乙醇沉淀
2．1．2备择方案1异丙醇沉淀DNA
2．1．3辅助方案1酚的平衡及酚／氯仿／异戊醇的配制
2．1．4辅助方案2丁醇浓缩DNA
2．1．5辅助方案3醚抽提法去除残存酚、氯仿或丁醇
2．1．6备择方案2玻璃球法纯化DNA
2．1．7备择方案3RNA及DNA稀溶液的纯化和浓缩
2．1．8备择方案4乙醇沉淀法去除低分子量的寡核着酸和核着三磷酸
2．2从哺乳动物组织中制备基因组DNA
基本方案
2．3从植物组织中制备基因组DNA
2．3．1基本方案氯化铯离心法制备植物DNA
2．3．2备择方案用CTAB制备植物DNA
2．4从细菌中制备基因组DNA
2．4．1基本方案细菌基因组DNA的小量制备
2．4．2备择方案氯化铝法大规模制备细菌基因组DNA
2．4．3辅助方案从所得到的基因组DNA制备物中除去多糖
2．SA琼脂糖凝胶电泳
2．5AI基本方案大片段DNA在琼脂糖凝胶上的分离
2．5A．2辅助方案微型凝胶及中型凝胶
2．5B脉冲场凝胶电泳
2．5B．l基本方案倒转电场凝胶电泳
2．5B2备择方案错位均匀电场电泳（CHEF电泳）
2．5B．3辅助方案高分子量DNA样品和分子量标准物的制备
2．6从琼脂糖凝胶中分离和纯化大的DNA限制性酶切片段
2．6．l基本方案1琼脂糖凝胶电洗脱
2．6．2基本方案2NA－45纸电泳
263基本方案3用低熔点琼脂糖凝胶分离DNA片段
2．6．4备择方案1使用B琼脂糖酶消化法从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA
2．6．5备择方案2用玻璃珠法从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA
2．6．6辅助方案用溴化乙锭斑点定量法对DNA浓度进行快速估测
2．7非变性聚丙烯酸胺凝胶电泳
2．7．1基本方案
2．7．2备择方案1通过电洗脱从聚丙烯酸胺凝胶纯化片段
2．7．3备择方案2DEAE膜电洗脱法纯化标记片段
2．7．4辅助方案可重复使用的用于凝胶加样的塑料毛细管
2．8筛分型琼脂糖凝胶电泳
基本方案
2．9ASouthern印迹法
2．9A1基本方案用高盐缓冲液在尼龙股或硝酸纤维素膜上进行Southern印迹
2．9A2辅助方案紫外透射仪的校准
2．9A3备择方案1用碱性缓冲液在尼龙膜上进行Southern印迹
2．9A4备择方案2用向下毛细管转移法进行Sauthern印迹
2．9A5备择方案3从聚丙烯酸胺凝胶至尼龙膜的电转印法
2．9BDNA的斑点和狭线印迹
2．9B．1基本方案用多样抽滤加样器在不带电荷的尼龙膜和硝酸纤维素膜上进行DNA
斑点和狭统印迹
2．9B．2备择方案1用多样抽滤加样器在带正电荷的尼龙膜上进行DNA斑点和狭线印
迹
2．9B．3备择方案2DNA斑点印迹的手工制备
210DNA印迹的杂交分析
2．10．1基本方案放射性标记的DNA探针对DNA印迹的杂交分析
2．10．2备择方案用放射性标记的RNA探针对DNA印迹进行杂交分析
2．10．3辅助方案从杂交膜上除去探针
2．11变性聚丙烯酸胺凝胶电泳纯化寡核着酸
基本方案
第3章DNA和DRNA的酸学操作
3．1限制性内切酶消化DNA
3．1．1基本方案单酶单DNA样品消化
3．1．2备择方案1多限制性内切酶消化DNA样品
3．1．3备择方案2消化多个DNA样品
3．1．4备择方案3限制性内切酶对DNA样品的部分消化
3．1．5辅助方案DNA的甲基化
3．2用多种酶消化进行DNA作图
基本方案
3．3用限制酶部分消化进行DNA作图
基本方案
3．4核酸操作的常用试剂和放射性同位素
3．4．l贮液
3．4．210X酶缓冲液
3．4．3酶反应条件及应用
3．4．4核苷三磷酸（NTP）
3．4．5标记核酸的放射性同位素
基本方案酸沉淀法测定DNA和RNA中的放射性
备择方案柱离心法分离放射性标记DNA
3．5依赖于DNA的DNA聚合酶
3．51大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段
基本方案1标记DNA的3末端
基本方案2修复突出的3或5末端以产生平端
基本方案3随机寡核着酸引物介导的DNA标记
Klenow酶的其他应用
3．5．2T4DNA聚合酶
3．5．3天然T7DNA聚合酶
3．5．4经修饰的T7DNA聚合酶
3．5．sTaqDNA聚合酶
3．6不依赖于模板的DNA聚合酶
末端脱氧核着酸转移酶（末端转移酶）
37依赖RNA的DNA聚合酶
反转录酶
3．8依赖DNA的RNA聚合酶．
噬菌体的RNA聚合酶：SP6、T7和T3
3．9不依赖DNA的RNA聚合酶
POly（A）聚合酶
3．10磷酸酶和激酶
3．10．1碱性磷酸酶
3．10．2T4多核着酸激酶
基本方案1正向反应标记5端
基本方案2交换反应标记5端
其他应用
3．11外切核酸酶
3．11．l单链5一3和3一5外切核酸酶
3．11．2双链5一3味端外切核酸酶
3．11．3双链3一5外切核酸酶
3．12内切核酸酶．
3．12．1Bal31核酸酶．
3．12．2SI核酸酶
3．12．3绿豆核酸酶
3．12．4微球菌核酸酶
3．12．5脱氧核糖核酸酶1（DNaseI）．
3．13核糖核酸酶．
3．13．1核糖核酸酶A（RNaseA）．
3．13．2核糖核酸酶H
3．13．3核糖核酸酶T1
3．14DNA连接酶
3．141T4DNA连接酶
3．14．2大肠杆菌DNA连接酶
3．15RNA连接酶
T4RNA连接酶
3．16DNA片段的亚克隆
3．161基本方案
3．16．2备择方案凝胶块中DNA片段的连接
3．17聚合酶链式反应构建重组DNA
基本方案DNA片段亚克隆
3．18非同位素探针的标记和比色检测
3．18．l基本方案1用切口平移法制备生物素酸化的探针
3．18．2基本方案2用随机寡核青酸引物合成法制备生物素酸化探针
3．18．3辅助方案生物素酸化探针的比色法检测
3．18．4备择方案制备和检测地高辛标记的DNA探针f
3．19非同位素探针的化学发光检测
3．19．1基本方案生物素标记探针的化学发光检测＠
3．19．2备择方案地高辛标记探针的化学发光检测
3．19．3辅助方案紫外光源的标化
第4章RNA的制备和分析
4．l从组织培养细胞中提取细胞质RNA
4．1．1基本方案
4．1．2辅助方案除去混杂的DNA污染
4．2异硫氰酸弧法制备总RNA
4．2．l基本方案CaCl法纯化从培养细胞中提取的RNA
4．2．2备择方案1CaCl纯化组织RNA
4．2．3备择方案2从组织或培养细胞中一步法分离RNA
4．3酚／SDS法制备植物RNA
基本方案
4．4制备细菌RNA
4．4．1基本方案1从革兰氏阴性细菌中分离高质量的RNA
4．4．2基本方案2从革兰氏阳性细菌分离RNA
4．4．3备择方案从革兰氏阴性菌中快速分离RNA
4．5paly（A）+RNA的制备
基本方案
4．6用单链DNA探针进行mRNA的S1核酸酶作图分析
4．61基本方案用MI3模板进行mRNA的S1作图
4．62备择方案1从双链模板合成单链探针
4．6．3备择方案2用寡核着酸探针进行mRNA的定量S1作图分析
4．6．4辅助方案SI核酸酶mRNA定量分析的实验对照
4．7核酸酶保护试验
4．7．1基本方案
4．7．2辅助方案1RNA探针的提纯
4．7．3辅助方案2模板DNA的制备
4．8引物延伸
基本方案
4．9RNA的Narthern印迹和狭线杂交分析
4．9．l基本方案甲醛一琼脂精凝胶电泳分离RNA的Narthern杂交，
4．9．2备择方案1经戊二醛／二甲基亚矾变性处理的RNA的Narthern杂
4．9．3备择方案2经狭线印迹固定的未分级RNA样品的Northern杂交
第5章重组DNA文库的构建
5．1基因组DNA文库概述
5．1．1表现度与随机性
5．1．2亚基因组文库
5．1．3基因组DNA文库载体
5．2cDNA文库概述
5．3噬菌体文库的扩增
基本方案
5．4粘粒和质粒文库的扩增‘
基本方案
第6章重组DNA文库的筛选
6．1噬菌体文库的铺平板和转移
基本方案
6．2粘粒及质粒文库的铺平板和转移
基本方案
6．3应用DNA片段作探针
6．3．l基本方案在甲酸胺溶液中进行杂交
6．3．2备择方案在水溶液中进行的杂交
6．4使用合成寡核着酸作探针
6．4．1基本方案1在氯化钠／柠檬酸钠溶液（SSC）中杂交
6．4．2基本方案2在氯化四甲铵（TMAC）中杂交
6.4.3辅助方案混合寡核苷酸5末端标记
6．5噬菌体克隆的纯化
基本方案
6．6粘粒和质粒克隆的纯化
基本方案
6．7在人噬菌体噬斑中产生的融合蛋白的免疫筛选
6．7．1基本方案用抗体筛选人gtll表达文库
6．7．2备择方案在抗体筛选之前用IPTG诱导融合蛋白表达
6．8在杂交选择和翻译后进行的免疫筛选
某本方案
6．9概述筛选YAC文库和分析YAC克隆的策略
6．9．1YAC文库的构建
6．9．2中心实验室的YAC文库筛选
6．9．3筛选用的基因座特异性PCR试验的设计
6．9．4分析独立的YAC克隆
6．9．5YAC插入片段的亚文库的构建与分析
6．10对分离得到的YAC克隆的分析
6．10．l基本方案1含YAC的酵母菌株的培养和保存
6．10．2基本方案2制备YACDNA进行Southern印迹分析
6．10．3基本方案3制备用于脉冲电场凝胶电泳的包理于琼脂糖胶块中的酵母染色体
6．10．4基本方案4用PCR扩增法进行末端片段分析
6．10．5备择方案采用亚克隆至细菌质粒载体中分析末端片段
6．10．6辅助方案设计和制备pUC19－ES和pUC19－HS亚克隆载体
6．10．7基本方案5制备高分子量的含YAC的酵母DNA
6．10．8基本方案6制备和分析YAC插入片段的亚文库
7．0DNA测序方法概述．
7．0．1双脱氧测序（Sanger法）
7．0．2化学测序（Maxam－Gi比ert法）
7．0．3双脱氧法或化学测序法的选择
7．0．4放射性标记测序反应的备择标记
7．1DNA测序策略．；
7．1．l双脱氧测序．；
7．1．2化学测序
7．2构建用于DNA测序的嵌套式缺失突变体
7．2．l基本方案1用外切酶Ill构建单向缺失突变体
7．2．2辅助方案1用[a－35]dNTP使DNA免于外切酶III消化
7．2．3基本方案2用Ba131核酸酶构建嵌套式缺失突变体
7．2．4辅助方案制备M13mp测序载体以亚克隆Ba131消化的DNA片段
7．3制备DNA测序模板
7．3．1基本方案1制备单链M13噬菌体DNA
7．3．2基本方案2从小量裂解物中制备人噬菌体DNA
7．3．3基本方案3小量制备用于双脱氧测序的双链质粒DNA模板
7．3．4基本方案4用于双脱氧测序的双链质粒DNA的碱变性
7．3．5基本方案5制备用于热循环测序质粒或噬菌体DNA
7．4双脱氧法DNA测序
7．4．l基本方案1用测序酶进行标记／终止测序反应
7．4．2备择方案1使用Mn2+的标记／终止反应
7．4．3备择方案2使用TaqDNA聚合酶进行Sanger双脱氧测序
7．4．4备择方案3用5末端标记引物一步法进行测序反应
7．4．5基本方案2用标记核昔酸进行热循环测序反应
7．4．6备择方案4用5末端标记引物进行热循环测序反应
7．5化学发光双脱氧DNA测序法
7．5．1基本方案利用生物素标记引物的化学发光DNA测序法
7．5．2备择方案1链亲和素和生物素酸化碱性磷酸酶两步检测法（间接法）
7．5．3备择方案2用半抗原标记引物进行测序并用抗体碱性磷酸酶偶联物进行检测
7．6用于测序的变性凝胶电泳
7．6．1基本方案测序胶的灌制、电泳及处理
7．6．2备择方案l缓冲液梯度测序胶
7．6．3备择方案2电解质梯度测序胶
7．6．4备择方案3含甲酸胺的测序胶－
7．7DNA和蛋白质序列的计算机处理和分析
7．7．1序列数据的录入
7．7．2序列数据的确证和组装
7．7．3限制酶作图‘
7．7．4核酸结构预测
7．7．5寡核着酸设计策略
7．7．6蛋白质编码区的识别
7．7．7同源性检索
7．7．8向分子生物学家提供的基因序列库及其他计算机资源
附录
第8章克隆化DNA的诱变
8．1无需表型选择的寡核苷酸介导的诱变
基本方案
8．2A用简并寡核苷酸诱变：在小段DNA序列中产生大量突变
基本方案
8．ZB基因合成：用互为引物的长段寡核着酸合成目的序列
基本方案
8．3区域特异性诱变
8．3．1基本方案
8．3．2辅助方案突变克隆的富集
8．4DNA的接头分区诱变
8．4．l辅助方案用嵌套缺失体和互补寡核着酸进行接头分区诱变
8．4．2备择方案寡核着酸介导的接头分区诱变
8．5利用聚合酶链式反应（PCR）的定点诱变
8．5．l基本方案1通过PCR引人限制性内切酶位点
8．5．2基本方案2利用PCR引入点突变
8．5．3备择方案通过顺序PCR步骤引入点突变‘
第9章DNA导入哺乳动物细胞‘
9．1磷酸钙转染法
9．1．l基本方案磷酸钙-DNA在HEPES中形成沉淀的转染方法
9．1．2辅助方案l哺乳动物细胞的甘油／二甲基亚砜7休克
9．1．3备择方案在BES中形成磷酸钙-DNA沉淀的高效转染方法
9．1．4辅助方案2质粒DNA的纯化
9．2利用DEAE-葡聚精的转染
9．2．1基本方案
9．2．2备择方案1DEAE-葡聚糖大批量转染
9．2．3备择方案2悬浮细胞的转染
9．2．4备择方案3用氯险处理细胞
9．3电穿孔转染法
9．3．l基本方案电穿孔法转染哺乳动物细胞
9．3．2备择方案植物原生质体细胞的电穿孔转染
9．4脂质体介导的转染
9．4．l基本方案用脂质体介导短暂表达
9．4．2备择方案用脂质体进行稳定转染
9．5将基因稳定转染至哺乳动物细胞
9．5．l基本方案
9．5．2哺乳动物细胞的选择标记
9．6遗传报道基因系统概述
9．6．l报道载体的设计
9．6．2体外报道分子分析方法
9．63体内报道分子分析方法
9．7A报道基因活性的同位素分析方法
9．7A．1基本方案1CAT活性的层析分析法
9．7A．2备择方案1原位裂解细胞的CAT分析方法
9．7A．3备择方案2CAT活性的相一抽提分析法
9．7A．4基本方案2人生长激素的放射免疫分析法
9．7B非同位素分析报道基因活性
9．7B．l基本方案1萤火虫荧光素酶报道基因分析
9．7B．2备择方案冻融裂解的细胞的荧光素酶分析
9．7B．3基本方案2b-半乳精着酶报道基因的化学发光分析
9．8转染后RNA的直接分析
9．8．l转染效率
9．8．2RNA制备
9．8．3RNA分析
9．8．4启动子强度
9．9转染条件的优化
9．9．1DEAE-葡聚糖转染法
9．9．2磷酸钙转染法
9．9．3电穿孔法
9．9．4脂质体介导的转染
9．10反转录病毒转导系统概述
9．10．1反转录病毒生活周期
9．10．2无复制能力的载体
9．103有复制能力的载体
9．10．4包装细胞系和病毒的产生
9．10．5安全性问题
9．11建立特异的反转录病毒产毒细胞系
9．11．l基本方案1将反转录病毒载体导入包装细胞系
gll．2基本方案2测定病毒滴度：高滴度产病毒细胞克隆的鉴定
9．11．3备择方案产毒克隆的快速评价
9．11．4辅助方案培养细胞的Xgl染色
9．12大规模制备和浓缩反转录病毒原液
9．12．l基本方案用离心法制备和浓缩病毒原液
9．12．2备择方案用聚乙二醇均相沉淀及层析法浓缩病毒．．
9．12．3备择方案用分子量截留滤膜进行浓缩
9．13反转录病毒原液中辅助病毒的检测
9．13．l基本方案通过药物抗性的水平传播分析辅助病毒
9．13．2备择方案用反转录酶分析法检测辅助病毒
9．14用反转录病毒在体外及体内感染细胞
9．14．1体外细胞感染
9．14．2在体内感染啮齿类动物
第互0章蛋白质的分析
10．1比色法测定蛋白质含量．
基本方案Bradford法
10．2蛋白质的单向SDS凝胶电泳
10．2．l电与电泳
10．2．2基本方案1变性（SDS）不连续凝胶电泳：Laemmh凝胶电泳法
10．23备择方案1在Tris－Tricine缓冲系统中电泳
10．2．4备择方案2在无尿素条件下用Tris缓冲液分离多肽
10．2．5备择方案3连续SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳
102．6备择方案4超薄凝胶的灌制和电泳
10．2．7辅助方案1一次灌制多块浓度均一的凝胶
10．2．8备择方案5在梯度凝胶中分离蛋白质
102．9辅助方案2一次灌制多块梯度胶
10．2．10基本方案2在均一浓度的微型凝胶上电泳
10．2．11辅助方案3制备多块梯度胶
10．3使用OFarrell系统的双向凝胶电泳
10．3．l基本方案1第l向凝胶（等电聚焦）
10．3．2基本方案2第2向凝胶
10．3．3备择方案1、2（第1向凝胶电泳）极端碱性、酸性蛋白的等电聚焦
10．3．4备择方案3小型凝胶双向电泳
10．3．5辅助方案组织来源的蛋白质样品的溶解和制备
10．4从已染色的凝胶中电洗脱回收蛋白质
基本方案
10．5凝胶中蛋白质的染色
1051基本方案1考马斯亮蓝染色
10．5．2基本方案2银染法
10．5．3备择方案非氨盐银染法
10．5．4基本方案3快速银染法
10．5．5辅助方案凝胶拍照
10．6检测转印到股上的蛋白质
10．6．l基本方案印度墨汁染色
10．6．2备择方案金染色
10．6．3辅助方案碱处理增强蛋白质的染色
10．7免疫印迹与免疫检测
10．7．1基本方案1用转移槽转印蛋白质
10．7．2备择方案1用半干转移系统转印蛋白质
10．7．3辅助方案转印后蛋白质的可逆染色
10．7．4基本方案2用第H抗体偶联物进行免疫检测
10．7．5备择方案2用亲和素一生物素偶联的第二抗体进行免疫检测
10．7．6基本方案3用发色底物显迹
10．7．7备择方案3用发光底物显迹
10．8凝胶过滤层析
10．8．1基本方案蛋白质的凝胶过滤分离
10．8．2备择方案蛋白质的凝胶过滤脱盐
10．8．3辅助方案凝胶介质和层析柱的选择
10．9离子交换层析
10．9．l基本方案
10．9．2辅助方案离子交换层析介质和层析柱的选择
10．10免疫亲和层析
10．10．1基本方案可溶性抗原或膜结合抗原的分离
10．10．2备择方案1抗原的批处理纯化
10．10．3备择方案2低pH洗脱抗原
10．11金属螫合亲和层析
10．11．l基本方案天然MCAC纯化带组氨酸尾的可溶性融合蛋白
10．11．2备择方案1变性条件下用MCAC纯化带组氨酸尾的不溶性融合蛋白
10．11．3备择方案2MCAC纯化蛋白的固相复性
10．11．4辅助方案1已纯化蛋白的分析和处理
10．11．5辅助方案2NTA介质的再生
10．12反相高效液相层析
10．12．l基本方案多肽和蛋白质的分离
10．12．2备择方案蛋白质的分离
10．12．3辅助方案水、缓冲液和溶剂的脱气
10．13离子交换高效液相层析
10．13．l基本方案1阴离子交换HPLC
10．13．2基本方案2阳离子交换HPLC
10．14分子排阻高效液相层析
基本方案
10．15免疫沉淀法
10．15．l基本方案用抗体一SePharose偶联物免疫沉淀放射性标记抗原
10．15．2辅助方案制备抗体一Sepharose偶联物
10．15．3备择方案1用抗Ig血清免疫沉淀放射性标记抗原
10．15．4备择方案2用抗Ig抗体一SePharosc、蛋白A-或蛋白G－Sepharose或金黄色葡萄
球菌（S．aureus）免疫沉淀放射性标记抗原
10．15．5备择方案3使用更剧烈的解离和洗涤条件的免疫沉淀
10．15．6备择方案4用抗体七ePharose琼脂精偶联物免疫沉淀非标记抗原
10．16克隆化基因的体外转录和翻译
基本方案
10．17蛋白质的生物合成标记、
10．17．1基本方案用［‘S]甲硫氨酸短时间标记悬液中的细胞
10．17．2备择方案1用［S]引甲硫氨酸短时间标记贴壁培养细胞
10．17．3备择方案2用［S甲硫氨酸长时间标记细胞
10．17．4备择方案3用［‘S]甲硫氨酸对细胞进行脉冲追踪标记
10．17．5备择方案4用其他氨基酸进行生物合成标记
10．17．6辅助方案TCA沉淀法确定放射性标记的掺入量
10．18分离蛋白质用于微量序列分析
10．181基本方案1测定在PVDF膜上样品的氨基酸序列
10．18．2辅助方案SDS－PAGE准备蛋白质样品
10．18．3基本方案2测定N-末端封闭蛋白质的内部序列
第11章免疫字
11．1酶与抗体的偶联
11．1．l基本方案辣根过氧化物酶（HRPO）与抗体的偶联
11．1．2备择方案碱性磷酸酶与抗体的偶联
11．2酶联免疫吸附测定（ELISA）
11．2．l基本方案用间接ELISA法检测特异性抗体
11．2．2备择方案1直接竞争ELISA法检测可溶性抗原
11．2．3备择方案2抗体夹心ELISA法检测可溶性抗原
11．2．4备择方案3双抗体夹心ELISA法检测特异性抗体
11．2．5备择方案4直接细胞ELISA法检测细胞表面抗原
11．2．6备择方案5间接细胞ELISA法检测对表面抗原具有特异性的抗体
11．2．7辅助方案l交叉连续稀释法确定最佳试剂浓度
11．2．8辅助方案2制备细菌细胞裂解物抗原
11．3单克隆抗体上清液和腹水的制备
11．3．1基本方案1单克隆抗体上清的制备
11．3．2备择方案1单克隆抗体上清的大量制备
11．3．3备择方案2大量制备杂交瘤或细胞系
11．3．4基本方案2含单克隆抗体的腹水的制备‘
11．4单克隆抗体的纯化
11．4．1基本方案用蛋白A－SephArOsc进行纯化
11．4．2备择方案1蛋白A－SePhArOse的备择缓冲液系统
11．4．3备择方案2用抗原一SePhArOse和抗鼠Ig－SePhArOsc进行纯化
11．5兔多克隆抗血清的制备
11．5．l基本方案肌肉内注射免疫法
11．5．2备择方案1皮内注射免疫法
11．5．3备择方案2皮下组织注射免疫法
11．5．4备择方案3耳动脉放血
11．6从抗血清、腹水或杂交瘤上清液中纯化IgG抗体
11．6．1基本方案用硫酸铰沉淀IgG
11．6．2备择方案用DEAE－Affi－Gel－Blue层析法分级分离IgG
11．7免疫原性肽的选择
11．8抗肽抗体的制备
11．8．墓基本方案通过化学偶联法用MBS将合成肽偶联到担体蛋白上
11．8．2备择方案用戊二醒将合成肽通过化学偶联法偶联到担体蛋白质上
第12章DNA-蛋白质相巨作用
12．1从哺乳动物细胞中制备核提取物和细胞质提取物
12．1．1基本方案核提取物的制备
12．1．2辅助方案1细胞核提取方法的优化
12．1．3辅助方案2细胞质（S－100）组分的制备
12．2DNA结合蛋白在凝胶电泳中的迁移率变动分析
12．2．1基本方案低离子强度聚丙烯酸胺电泳迁移率变动分析
12．2．2备择方案高离子强度聚丙烯酸胺电泳迁移率变动分析
12．3甲基化干扰分析法和尿嘧啶干扰分析法
12．3．l基本方案1甲基化干扰分析法
12．3．2基本方案2尿嘧啶干扰分析法
12．4DNA酶I足迹分析法
12．4．1基本方案DNA酶1足迹分析法
12．4．2辅助方案用光密度及数值分析法决定蛋白质结合的平衡常数
12．4．3备择方案粗制品的DNA酶1足迹分析法
12．5蛋白质与核酸的紫外交联
12．5．l基本方案用澳脱氧尿苷（BrdU）取代的探针进行紫外交联
12．5．2备择方案1用非澳脱氧尿苷（NON－BrdU）取代的探针进行紫外交联
12．5．3备择方案2原位紫外交联
12．6用生物素／链亲和素亲和系统纯化DNA结合蛋白
12．6．1基本方案
12．6．2备择方案1用微型柱进行纯化
12．6．3备择方案2用链亲和素-琼胀糖进行纯化
12．7编码DNA结合蛋白的cDNA的检测、纯化和鉴定
12．7．1基本方案用识别位点DNA筛选gtll表达文库
12．7．2备择方案干燥膜的变性／复性
12．7．3辅助方案从重组溶原菌中制备粗提物鉴定DNA结合蛋白的活性
12．8用体外合成的蛋白质分析DNA蛋白质相互作用
基本方案
12．9序列特异性DNA结合蛋白的亲和层析纯化
12．9．1基本方案1DNA亲和介质的制备
12．9．2备择方案将DNA偶联于渍化氰活化琼脂精上
12．9．3辅助方案1用制备性凝胶电泳纯化寡核苷酸
12．9．4基本方案2DNA亲和层析法
12．9．5辅助方案2非同位素竞争性DNA的选择和制备
第13章酿酒酵母．；
13．1酵母菌培养基的制备
13．1．1液体培养基
13．1．2固体培养基
13．1．3菌株的保存与复苏‘‘
基本方案冷冻菌种保存液的制备与接种
13．2酵母菌的培养与操作
13．2．1基本方案1液体培养基培养酵母菌
13．2．2基本方案2固体培养基培养酵母菌
13．2．3基本方案3细胞密度检测
13．2．4基本方案4影印平板检测酵母菌表型
13．2．5基本方案5H倍体细胞的构建
13．2．6基本方案6Th倍体细胞的泡子形成
13．2．7基本方案7四分体的制备与剖分
13．2．8辅助方案解剖针的制作
13．2．9备择方案随机炮子分析
13．3酵母菌细胞的诱变
13．3．1基本方案甲乙硫醚诱变
13．3．2备择方案紫外光诱变
13．4酵母菌的克隆载体与基因图谱
13．4．l质粒分类命名
13．4．2精选的质粒和基因图谱，
13．5酵母菌表达载体
13．6酵母菌载体与表达产物的检测
13．6．1基本方案1研究基因调控的切cZ融合载体
13．6．2基本方案2卜半乳糖着酶在液体培养基中的表达与检测
13．7将DNA导入酵母菌细胞中
13．71基本方案乙酸锂转化
13．7．2备择方案1原生质体转化
13．7．3备择方案2电穿孔转化
13．74辅助方案单链高分子量的担体DNA的制备
13．8利用互补作用克隆酵母菌基因
基本方案
13．9酵母细胞的质粒分离除去
基本方案
13．10克隆化酵母DNA的操作
13．10．1基本方案1整合性转化‘
13．10．2基因置换技术
基本方案2整合性破坏‘
基本方案3基因破坏一步法
基本方案4移换
13．10．3基本方案5质粒缺口修复
13．10．4基本方案6穿梭质粒
13．11酵母DNA的制备
13．11．1基本方案从酵母菌中快速分离质粒DNA
1311．2备择方案酵母染色体DNA的快速分离
13．12酵母菌RNA的制备
13．12．1基本方案热酸性酚抽提法制备酵母RNA
13．12．2备择方案1玻璃珠法制备RNA
13．12．3备择方案2paly（A）+RNA的制备
13．13制备酵母蛋白抽提物．
13．13．l基本方案原生质体制备及裂解
13．13．2辅助方案差速离心法制备细胞核
13．13．3备择方案1玻璃球破细胞法
13．13．4备择方案2液氮破细胞法
13．14利用相互作用阱／双杂合系统确定相互作用的蛋白质
13．14．1基本方案1鉴定诱饵蛋白的特性
13．14．2基本方案2相互作用蛋白的捕获
13．14．3辅助方案1制备鲑精担体DNA
13．14．4辅助方案2附加的特异性筛选方法
第14章原位杂交和免疫组织化学
14．1组织、胚胎及单细胞的固定、包理及切片
14．1．l基本方案组织和胚胎的多聚甲醛固定及石蜡包理
14．1．2备择方案悬浮及培养细胞的PFA固定
14．1．3辅助方案1成年小鼠的灌流
14．1．4辅助方案2蜡块中样品的切片
14．1．5辅助方案3预包被载玻片的处理
14．2冰冻切片
14．2．l基本方案样品制备及切片
14．2．2辅助方案1用于原位杂交的冰冻切片的固定
14．2．3辅助方案2组织固定和蔗糖浸制
14．3细胞RNA的原位杂交
174．3．l基本方案石蜡切片或细胞的杂交实验
14．3．2备择方案冰冻切片的杂交实验
14．3．3辅助方案lS标记的核糖核酸探针和含硫探针竞争剂护
14．3．4辅助方案2S标记的双链DNA探针的合成
14．4杂交探针的检测
14．4．l基本方案1胶片放射自显影
14．4．2基本方案2胶乳放射自显影
14．4．3辅助方案放射自显影用稀释胶乳的制备
14．5放射自显影原位杂交玻片的复染和压片固定
14．5．l基本方案吉姆萨（Giemsa）染色法
14．5．2备择方案1苏木精／伊红染色法
14．5．3备择方案2甲苯胺蓝染色法
14．5．4备择方案3HOECHST染色法
14．6免疫组织化学法
14．6．1基本方案l单层生长细胞的免疫荧光标记
14．6．2备择方案1悬浮细胞的免疫荧光标记
14．6．3基本方案2组织切片的免疫荧光标记
14．6．4备择方案2链亲和素一生物素结合物免疫荧光标记法
14．6．5备择方案3组织切片的免疫金标记
14．6．6备择方案4组织切片的免疫过氧化物酶标记
14．6．7备择方案5组织切片的免疫荧光双标记法
14．7用非同位素探针进行原位杂交和检测
14．7．l基本方案1荧光原位杂交
14．7．2杂交信号的放大
辅助方案1生物素酸化信号的放大
辅助方案2地高辛标记探针的信号放大
14．7．3非同位素标记探针的酶法检测
备择方案1辣很过氧化物酶法检测
备择方案2碱性磷酸酶检测法
14．8低丰度核酸的检测：原位PCR和杂交
14．8．l总体设计
14．8．2基本方案1DNA和RNA靶序列的原位PCR扩增
14．8．3备择方案一步法反转录及扩增
14．8．4基本方案2ISPCR扩增的产物的杂交和检测
14．8．5辅助方案1AES浸泡处理载玻片的制备
14．8．6辅助方案2在载玻片上制备康位PCR样品
14．8．7辅助方案3用P标记寡核苷酸探针
第互5章聚合酶链式反应（PCR）
15．1PCR扩增DNA：标准程序和优化
基本方案
15．2利用PCR产物直接进行DNA序列测定
15．2．1基本方案1不对称PCR产生的单链产物的双脱氧测序
15．2．2备择方案1单引物重复扩增制备单链模板以用于双脱氧测序
15．2．3备择方案2制备用于双脱氧测序的双链PCR产物
15．2．4备择方案3用人噬菌体核酸外切酶消化双链PCR产物得到单链进行双脱氧
测序
15．2．5基本方案2PCR产物的标记和化学测序
15．2．6备择方案4PCR产物的基因组测序
15．3通过PCR方法对微量DNA进行定量分析
基本方案
15．4PCR扩增RNA
15．4．l基本方案在最适条件下进行RNA的PCR扩增
15．4．2备择方案1避免长时间的共沉淀及退火步骤的方法
15．4．3备择方案2将cDNA直接用于扩增反应
15．4．4辅助方案粗制RNA的快速提取
15．5用于基因组测序及足迹分析的连接介导PCR
15．5．l基本方案连接介导的单侧PCR
15．5．2辅助方案1从单层细胞制备基因组DNA以用于DMS足迹分析
15．5．3辅助方案2从悬浮细胞中制备用于DMS足迹分析的基因
15．5．4辅助方案3用于化学测序的基因组DNA的制备
15．6利用单侧PCR（铺式PCR）进行cDNA扩增
15．6．1基本方案1扩增已知序列的下游（端）区段
15．6．2基本方案2扩增已知序列上游（5端）区段
15．7PCR产物的分子克隆
15．7．l基本方案产生T－A突出端
15．7．2备择方案1产生半位点
15．8通过PCR差异展示mRNA
基本方案
第16章蛋白质的表达
16．1概述：蛋白质在大肠杆菌中表达
16．1．1用大肠杆菌进行基因表达的一般策略
16．1．2特定的表达方案
16．1．3基因表达的疑难分析
16．2T7RNA聚合酶／启动子表达系统
16．2．1基本方案用双质粒系统进行表达
16．2．2备择方案1质粒编码蛋白的选择性标记
16．2．3备择方案2通过M13噬菌体mGP1-2感染的表达
16．3用带入噬菌体调节序列的载体进行表达
16．3．1基本方案1基因表达的温度诱导
16．3．2基本方案2基因表达的化学诱导
16．3．3辅助方案1用pSKF系列载体进行天然基因克隆
16．3．4辅助方案2融合基因在PSKF301中的构建和拆分
16．4融合蛋白载体表达概述
16．4．1表达蛋白的可溶性
16．4．2表达蛋白的稳定性
16．4．3裂解融合蛋白以除去担体蛋白
16．5融合蛋白的酶解和化学裂解
16．5．l基本方案1用Xa因子进行融合蛋白的酶解
16．5．2辅助方案用Xa因子进行变性融合蛋白的裂解
16．5．3备择方案1用凝血酶进行融合蛋白的酶解
16．5．4备择方案2与分离介质结合的GST融合蛋白的酶解
16．5．5备择方案3用肠激酸进行融合蛋白的酶解
16．5．6基本方案2用溴化氰对融合蛋白进行化学降解
16．5．7备择方案4用羟胺化学裂解融合蛋白
16．5．8备择方案5低PH下水解融合蛋白进行化学裂解
16．6lacZ和trpE融合蛋白的表达及纯化
基本方案
16．7谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的表达及纯化
基本方案
16．8硫氧还蛋白融合蛋白的表达和纯化
16．8．1基本方案硫氧还蛋白融合蛋白的构建和表达
16．8．2辅助方案1用弗氏细胞压碎器裂解大肠杆菌
16．8．3辅助方案2硫氧还蛋白融合蛋白的渗透性释放
16．8．4辅助方案3用热处理纯化硫氧还蛋白融合蛋白
16．9杆状病毒表达系统的概述
16．9．l杆状病毒表达系统
16．9．2昆虫细胞中蛋白质的翻译后修饰
16．9．3用杆状病毒表达系统超量表达蛋白的步骤
16．9．4用于杆状病毒表达系统的试剂、溶液和设备
16．10昆虫细胞培养物及杆状病毒毒种贮液的制备
16．10．l基本方案1昆虫细胞的保存和培养
1610．2基本方案2杆状病毒毒种贮液的制备
16．10．3辅助方案用蚀斑试验测定病毒贮液的滴度，
16．11重组杆状病毒的产生和重组蛋白的表达分析
16．11．1基本方案1用野生型病毒线性化DNA共转染
16．11．2备择方案用野生型病毒环状DNA共转染
16．11．3辅助方案1野生型杆状病毒的纯化
16．11．4基本方案2编码b-半乳糖甘醇的重组杆状病毒的纯化
16．11．5辅助方案2裸眼筛选重组杆状病毒
16．11．6基本方案3重组病毒的蛋白质分析
16．11．7辅助方案3重组蛋白质的代谢标记
16．11．8辅助方案4蛋白质生产高峰期的确定
16．11．9基本方案4重组蛋白质的大规模生产
16．12概述：蛋白质在哺乳动物细胞中表达
16．12．l病毒介导的基因转移
16．12．2短暂表达
16．12．3DNA的稳定转染
16．12．4转染DNA的扩增
16．12．5表达载体
16．12．6表达系统的选择
16．12．7问题的发现与解决
16．13用COS细胞短暂表达蛋白质
基本方案
第17章蛋白质磷酸化的分析
17．1蛋白质磷酸化概述
17．2培养细胞用于；标记和用于免疫沉淀的细胞裂解物的制备
17．2．1基本方案培养细胞的P1标记和温和去污剂裂解法
17．2．2备择方案SDS煮沸法裂解细胞
17．3磷酸氨基酸分析
17．3．1基本方案磷酸氨基酸的酸水解和双向电泳分析
17．3．2备择方案碱处理提高转移至滤膜上的磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸的检测
17．4分析非标记蛋白质的磷酸化作用
17．4．l基本方案1用抗磷酸酪氨酸抗体和[I]标记蛋白A进行免疫印迹分
17．4．2备择方案用增强化学发光洁（ECL）检测结合的抗体
17．4．3基本方案2磷酸酶消化法鉴定磷酸化的蛋白质
附录
附录1试剂和溶液
附录2标准测量值、数据和缩写
常用缩写
实用测量值和数据
核酸的特性
放射性
离心机和转子
附录3生物化学和分子生物学常用技术，
附录3A放射自显影
附录3B玻璃器皿的硅化
附录3C透析与超滤
附录3D用吸收光谱法和荧光光谱法定量DNA和RNA
附录3E通过沉默突变引入限制性酶切位点
附录4试剂和设备的供应商
附录5参考文献
致谢
京公网安备 11010102004214号