自从这本经典的蛋白质纯化指南20年前问世以来，已经指导了无数科研工作者和学生进行纯化、鉴定蛋白质，并处理各种蛋白质和酶。全面更新的第二版，全面升级了本领域的现有方法，反映了过去20年来取得的巨大进步。特别是自第一版出版以来，蛋白质组学，质谱和DNA技术等新技术的发展使这一领域发生了全面革新，但尽管如此，蛋白质纯化仍然是了解蛋白质功能不可或缺的第一步。第二版延续了以往的风格，以简明易懂、便于操作的文风，展示了最前沿、最经典的方法，无论是专家，还是刚刚涉足这一领域的科研人员，无论是生物化学、细胞和分子生物学、遗传学，还是肿瘤学、药理学、免疫学等领域的研究人员，均能够从本书中找到或传统或尖端的坚实的实验方法，遵循此操作指南，成功地在自己的实验室建立并完善这些实验技术。
样章试读
目录
- 撰稿人
序言
1.为什么需要纯化酶?
第一部分 建立纯化程序
2.蛋白质纯化的策略和思路
1.总体思路
2.蛋白质来源
3.提取
4.批量纯化的步骤
5.纯化的精制步骤
6.结论
参考文献
3.生物信息学在蛋白质纯化方案设计中的应用
1.从氨基酸序列中可以了解到什么
2.仍不能预测到的是什么
3.结论
参考文献
4.制作一张蛋白质纯化的汇总表
1.引言
2.脚注的重要性
3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析对于主要蛋白质组分的价值
4.常见的错误和问题
第二部分 处理蛋白质和酶的常规方法
5.建立一个实验室
1.支撑材料
2.分析检测的必要条件
3.蛋白质分级的必要条件
6.缓冲液:原理和操作
1.引言
2.理论
3.缓冲液的选择
4.缓冲液的准备
5.挥发性缓冲液
6.宽范围的缓冲液
7.缓冲液储备液的配制
参考文献
7.酶活的测定
1.引言
2.催化活性的原理
3.酶活性的测定
4.反应分析混合物的配方设计
5.讨论
致谢
参考文献
8.蛋白质定量
1.引言
2.准备试剂的说明
3.紫外光谱吸收方法
4.染料染色蛋白质分析
5.考马斯亮蓝蛋白质检测法(Bradford法)(范围:1-50μg)
6.Lowry检测法(Alkaline Copper还原法)(范围:5-100μg)
7.二喹啉甲酸检测法(BCA法)(范围:0.2-50μg)
8.胺衍生法(范围:0.05-25μg)
9.基于去垢剂的荧光检测法(范围:0.02-2μg)
10.总论
致谢
参考文献
9.蛋白质浓缩和其他溶解物的去除
1.层析
2.电泳
3.透析
4.超滤
5.冷冻干燥
6.沉淀
7.结晶
参考文献
10.蛋白质稳定性的保持
1.蛋白质失活的原因
2.常规处理方法
3.浓缩和溶解条件
4.稳定性试验和储藏条件
5.蛋白质水解和蛋白酶抑制剂
6.蛋白质活性损失
第三部分 重组蛋白质的表达和纯化
11.有效表达重组蛋白质方法的选择
1.引言
2.大肠杆菌(Escherichia coli)
3.毕赤酵母(Pichia pastoris)
4.杆状病毒/昆虫细胞
5.哺乳动物细胞
6.蛋白质特性
7.重组蛋白质的应用
8.结论
参考文献
12.细菌系统内外源蛋白质的表达
1.引言
2.用E.coli表达外源蛋白质
3.设计一个细菌表达方案
4.方案条件的评估
5.目标蛋白的分析
6.克隆
7.准备T4 DNA聚合酶-处理的DNA片段
8.E.coli细胞质中的表达
9.E.coli细胞质中目标蛋白的表达
10.E.coli中外源蛋白质表达的分析
11.在自身诱导培养基中小规模表达培养
12.蛋白质的细胞质表达
13.E.coli中细胞质目标蛋白的表达
14.小规模渗透压休克的操作
15.表达外源蛋白质的其他细菌体
16.其他载体和诱导条件
17.生产规模
致谢
参考文献
13.毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达
1.引言
2.其他真菌表达系统
3.培养基和细菌操作技术
4.基因工程菌的构建
5.基因的准备和载体的选择
6.电穿孔转化
7.DNA制备
8.重组蛋白质生产菌株的检查
9.进一步分析——Yeastern印迹
10.重组蛋白质翻译后修饰(蛋白酶作用和糖基化)
11.表达暗盒多重拷贝的选择
参考文献
14.杆状病毒——昆虫细胞表达系统
1.引言
2.杆状病毒生物学和分子生物学的简述
3.杆状病毒表达载体
4.杆状病毒表达载体技术——初期阶段
5.杆状病毒表达载体技术——后期阶段
6.杆状病毒转移质粒的修饰
7.亲代杆状病毒基因组的修饰
8.杆状病毒的另外一半——昆虫细胞系统
9.杆状病毒表达载体的新一代昆虫细胞宿主
10.杆状病毒基本操作规程
参考文献
15.瞬间基因转移到哺乳动物细胞实现对重组蛋白质的生产
1.引言
2.常用于TGE方法中的HEK293和CHO细胞系
3.HEK293和CHO细胞的表达载体
4.悬浮液中HEK293和CHO细胞系的培养
5.转染方法
6.结论
致谢
参考文献
16.蛋白质表达的标签
1.引言
2.设计融合标签蛋白时考虑的因素
3.蛋白质亲和标签
4.促溶蛋白标签
5.蛋白标签的去除
6.结论
致谢
参考文献
17.可溶性包含体蛋白质的重折叠
1.引言
2.常见的重折叠因素
3.常规步骤
4.常规操作规程
5.对操作流程的评价
6.蛋白质重折叠的测试筛选
7.其他的重折叠步骤
8.重折叠数据库:重折叠
9.增加可溶蛋白质比例的策略
10.结论
参考文献
第四部分 提取物和亚细胞组分的分离
18.生物提取物制备的研究进展——用于蛋白质纯化
1.引言
2.化学法和酶法破碎细胞
3.机械法破碎细胞
4.结束语
5.细胞破碎的步骤、试剂和注意事项
参考文献
19.亚细胞器官的分离和结构
1.引言
2.亚细胞蛋白质组的提取和初步分离
参考文献
第五部分 纯化步骤:批量法
20.蛋白质沉淀技术
1.引言
2.硫酸铵沉淀
3.聚乙烯亚胺沉淀
4.其他方法
5.沉淀法分离蛋白质的常规操作
参考文献
21.用于去除核酸的Affi-Gel蓝胶和核苷酸结合蛋白质的初步富集
1.代表性的操作规程
参考文献
第六部分 纯化步骤:层析法
22.离子交换层析
1.引言
2.原理
3.固定相
4.结合条件
5.洗脱条件
6.离子交换柱的操作
7.例子:复合蛋白质混合物的分离
8.例子:整体柱的高分辨率分离
参考文献
23.凝胶过滤
1.原理
2.操作
24.羟磷灰石柱用于蛋白质层析
1.引言
2.机理
3.化学特性
4.纯化操作规程
5.制备实验室用的柱子
6.制备工业规模的柱子
7.应用
参考文献
25.疏水层析(HIC)在蛋白质纯化中的理论和应用
1.理论
2.HIC吸附剂的最新技术
3.使用HIC吸附剂的步骤
参考文献
第七部分 纯化步骤:亲和法
26.亲和层析柱:常规方法
1.引言
2.亲和基质的选择
3.配基的选择
4.化学吸附
5.纯化方法
参考文献
27.固定化金属亲和层析(IMAC):综述
1.IMAC配基和固相离子的概述
2.IMAC的应用
3.结论
致谢
参考文献
28.多羟基反应单克隆抗体的鉴定、生产和应用——用于免疫亲和层析
1.引言
2.多羟基反应单克隆抗体
3.结论
公告
参考文献
第八部分 纯化步骤:电泳法
29.单向凝胶电泳
1.背景
2.聚丙烯酰胺凝胶
3.方法的原理
4.步骤
5.凝胶中蛋白质的检测
6.标准蛋白质
7.分子量的测定
8.制备电泳
参考文献
30.等电聚焦和双向凝胶电泳
1.引言
2.材料
3.方法
参考文献
31.蛋白质凝胶染色方法:引言和综述
1.引言
2.常规考虑
3.仪器:检测和记录
4.总蛋白质检测
5.磷蛋白质的检测
6.糖蛋白质的检测
参考文献
32.凝胶中蛋白质的洗脱
1.引言
2.通过扩散来洗脱凝胶中的蛋白质
3.反相HPLC取代SDS凝胶
4.电泳洗脱
5.结论
参考文献
33.着重于化学发光检测对蛋白质印记进行优化
1.蛋白质印迹
2.蛋白质印迹的种类
3.检测方法
4.化学发光信号
5.常见问题及其原因
6.使用化学发光底物的印迹和操作规程的优化
参考文献
第九部分 膜蛋白和糖蛋白的纯化程序
34.去污剂:综述
1.引言
2.去污剂结构
3.溶液中去污剂的性质
4.利用去污剂的物理化学参数进行膜蛋白质的纯化
5.去污剂的去除及交换
6.选择合适的去污剂
7.结论
致谢
参考文献
35.膜蛋白质的纯化
1.引言
2.膜的制备
3.天然膜蛋白的溶解
4.膜蛋白质的纯化
5.去污剂的去除及交换
6.重组整合膜蛋白质的表达和纯化
参考文献
36.重组G蛋白质偶联受体的纯化
1.引言
2.蛋白质增溶的一般注意事项
3.蛋白质纯化的一般注意事项
4.重组神经降压素受体NTS1的增溶及纯化
5.纯化蛋白质NTS1的分析
6.结论
致谢
参考文献
37.整合膜蛋白在单室脂质体中的无细胞翻译
1.引言
2.无细胞翻译的概述
3.表达载体
4.基因克隆
5.PCR产物的清除
6.Flexi载体和PCR产物的消化反应
7.连接反应
8.转化反应
9.质粒DNA的纯化
10.mRNA的制备
11.脂质体的制备
12.小麦胚芽翻译的反应
13.密度梯度超速离心法进行纯化
14.脂蛋白体的特点
15.规模化纯化的注意事项
16.同位素标记进行结构研究
17.结论
致谢
参考文献
第十部分 纯化蛋白质的特性
38.蛋白质纯度测定
1.蛋白质的组成和活性分析
2.电泳法
3.色谱法
4.沉降速度测定法
5.质谱法
6.光散射法
参考文献
39.蛋白质亚基的存在及其大小和分子量的测定
1.引言
2.化学方法
3.传输方法
4.散射方法
5.蛋白质亚基的存在
参考文献
40.翻译后修饰蛋白质的定性与定量
1.引言
2.用于鉴定PTMs的富集技术
3.硝化蛋白的修饰
4.甲基化和乙酰化
5.质谱分析
6.CID、ECD和ETD的对比
7.PTMs的定量分析
8.展望
致谢
参考文献
第十一部分 其他技术
41.表达和纯化相应的方法
1.引言
2.基于终端使用的策略
3.构建表达结构的平行克隆策略
4.用于鉴别合适结构的小规模表达筛选
5.分析检测蛋白质以进行筛选
6.大规模平行表达
7.结论
致谢
参考文献
42.氧敏感蛋白的分离技术:以[4F_E-4S]-FNR为例
1.引言
2.4F_E-FNR的厌氧分离.
3.含FNR的[4F_E-4S]^2+族蛋白质的特征
4.总结
参考文献
第十二部分 结束语
43.纯化程序的再思考
1.引言
44.蛋白质生物化学中重要的却鲜为人知(或易被忽视)的几点
1.引言
2.SDS凝胶电泳的样品制备
3.缓冲液
4.色谱
5.过滤过程中的蛋白质吸收
6.塑料制品中的化学物浸出
7.尿素中的氰酸盐
参考文献
撰稿人索引
索引
京公网安备 11010102004214号