MicroRNA在动植物的生长、法在于、分化、生殖等生理过程汇总发挥着重要的作用，本书是最新的关于microRNA研究的方法学专著。两位主编，John J.Rossi博士和Gregory J.Hannon博士，分别来自美国加州生物科学研究所&贝克曼研究所和美国冷泉港实验室，他们都是RNA干扰领域的知名专家。参与编写的34位作者分别来自不同国家的13个研究小组，在microRNA研究的各个领域取得过突破性成果。
样章试读
目录
- 作者
第一部分 MicroRNA及其靶标的鉴定
1.病毒microRNA的鉴定
ChirstopherS．SullivanandAdamGrundhoff
1.引言
2.病毒microRNA候选分子的计算机预测
2.1 计算机鉴定microRNA的原理
2.2 运用VMir预测病毒microRNA候选分子
3.病毒microRNA候选分子的芯片验证
3.1 芯片的设计
3.2 芯片的杂交
3.2.1 小RNA的胶纯化
3.2.2 标记和芯片的杂交
3.3 数据分析
4.结束语
参考文献
摘要
鉴于microRNA在基因表达调控方面的重要功能，一些病毒能编码其自身的mi-croRNA并不奇怪。虽然绝大多数的microRNA的功能仍未知，但我们至少可以推测一部分microRNA在病毒的生命周期中发挥着关键的作用，因此，鉴定新的病毒microRNA极其重要也极为有趣。目前已知的病毒（及宿主）microRNA，大部分是通过克隆小RNA的方法鉴定的。由于病毒基因组较小，因而特别适合利用基于计算机的各种预测方法对microRNA候选基因进行研究。本章就如何利用计算机预测方法结合高通量的基因芯片分析检测病毒基因组中的microRNA这一问题，提供了详细的方案。
2.应用鲁棒性机器学习算法预测microRNA基因及其靶标
1.引言
2.正确的使用机器语言
2.1 数据集
2.2 性能估算
2.3 性能测量
2.4 机器学习步骤
3.一种确定性和一种随机性的算法
3.1 支持向量机
3.2 Boosted遗传规划
4.使用支持向量机预测microRNA基因
4.1 决定输入
4.2 收集训练集
4.3 MicroRNA基因预测软件的训练及其性能估计
4.4 评估microRNA基因预测软件的性能
5.使用强化遗传算法预测microRNA靶标
5.1 决定输入
5.2 装配训练集
5.3 训练和评估microRNA靶基因预测软件
5.4 评估microRNA靶基因预测软件
6.小结
致谢
参考文献
摘要
MicroRNA是非编码RNA，却有可能调控数以千计编码蛋白质的基因的表达。目前预测microRNA基因的数目可能是已知的两倍，但决定microRNA作用靶标的机制尚未明确。机器学习算法可用于创建捕捉已验证实例特征的分类器，以确定基因组中的发夹是否与已证实的microRNA基因类似，或者mRNA的3′非翻译区是否具备已知的靶标特征。算法虽无法取代生物学的验证，但应始终用来指导实验设计。本章的重点涉及利用机器学习时必须处理的潜在问题，并通过实例的方法展示支持向量机和遗传规划如何对microRNA基因及其靶标进行预测
3.病毒编码microRNA的鉴定
SébastienPfeffer
1.引言
2.Rnl2（1-249）和腺苷酸化的3′接头寡核苷酸的纯化
3.小RNA片段的分离
4.纯化小RNA与腺苷酸化3′接头的连接
5.小RNA-3′接头与5′接头的连接
6.连接产物的逆转录反应
7.cDNA的首次PCr扩增
8.PmEi酶切PCr产物
9.二次PCr扩增
10.Bani酶切二次PCr产物
11.Bani酶切DNA的串联连接
12.串联体的末端加尾与克隆入T/A载体
13.文库的测序及注释
14.结束语
参考文献
摘要
RNA干扰是一种在生物体中普遍存在的机制，它从不同水平对基因的表达进行调控。小RNA是RNA干扰通路中的核心，根据其化学特性和作用模式可以划分成不同家族。在这些小RNA中，microRNA是在动物中研究得最多的一类。这些小的内源性RNA通过剪切靶标转录产物或干扰其翻译来实现基因的转录后调控。在植物和动物中已经发现了microRNA，在哺乳动物病毒中也已发现其存在。这就暗示了哺乳动物病毒依靠宿主的RNA干扰机器合成microRNA，这些microRNA对被感染的宿主基因组和病毒自身基因组均有作用。用于鉴定病毒microRNA的技术基本上与鉴定细胞micro-RNA的技术相同。通过计算机算法预测继而进行验证的方法是有效可行的。但鉴定病毒microRNA更直接和无偏向性的方法则为对病毒感染的细胞和组织建立的小RNA文库进行克隆和测序。
4.MicroRNA靶标预测的计算机方法
YukAWatanabe，MasaruTomita，andAkioKanai
1.引言
2.microRNA靶标识别的原理
3.microRNA靶标基因分析的数据源
4.microRNA靶标预测的计算机软件
5.microRNA靶标基因预测的原始策略
6.计算机预测的验证
7.结束语
致谢
参考文献
摘要
MicroRNA的发现引入了基因调控系统的一个新范式。大量的microRNA已在广泛的物种中被鉴定，其中大部分microRNA是通过非完全匹配结合到mRNA3′非翻译区的一个或多个位点上，从而下调mRNA的翻译。鉴定microRNA的靶基因被认为是理解microRNA在基因调控网络中所起作用的一个重要步骤。基于已观察到的一些特征（如两个核糖核酸分子的杂交程度）的规则，现已开发了专门的计算机算法，用于研究mi-croRNA与其靶标的相互作用。这些电脑模拟方法为microRNA靶标检测提供了重要的工具，并连同实验验证，有助于揭示microRNA的调节靶标。本章总结了关于microRNA识别靶标原理的知识和目前可用的预测microRNA靶基因的计算方法。
第二部 MicroRNA的表达、成熟与功能分析
5.DorshA复合体活性的体外和体内检测
YoontaELeEandV．NarryKim
1.引言
2.实验方法
2.1 体外分析pri-miRNA的加工
2.1.1 制备放射性标记的pri-miRNA转录本
2.1.2 制备microprocessor
2.1.3 Pri-microRNA加工的体外实验分析
2.2 体内分析pri-miRNA的加工
2.2.1 果蝇的DroshA或DGCR8的缺失
2.2.2 Pri-miRNA的RT-PCr分析
2.2.3 Northern杂交分析microRNA
致谢
参考文献
摘要
MicroRNA基因转录成为长的初级转录产物（pri-miRNA），并通过两种不同的核糖核酸酶III（RNasEIII），DroshA和Dicer加工成大约22个核苷酸的成熟microRNA。对microRNA发生过程进行遗传和生化分析的各种实验方法已经发展和完善起来。本章介绍了一种实验方法，用于分析被DroshA和其共同作用因子DGCR8调节的pri-miRNA生成过程。
6.MicroRNA基因表达的基因芯片分析
J．MichaelThomson，JoelS．Parker，andScottM．Hammond
1.引言
2.microRNA生物合成与作用方式的概述
3.microRNA表达的分析策略
4.microRNA基因芯片分析的注意事项
5.数据分析与说明
6.验证策略
7.microRNA基因芯片实验方案
7.1 芯片点阵
7.2 RNA提取
7.3 标记和清洗
7.4 杂交
8.数据分析
致谢
参考文献
摘要
MicroRNA是一类调控靶标mRNA表达的小分子非编码RNA。虽然已有上千种microRNA已被鉴定，但是很少有在功能上与特定的生物学途径相联系的。基因芯片分析是一种用于鉴定与生物过程相关和作为疾病分子标记的候选microRNA的理想策略。本章将介绍一种简单、低成本的基因芯片平台，可以优化microRNA的表达分析。
7.哺乳动物细胞microRNA的克隆与表达检测
GuihuASun，HaitangLi，andJohnJ．Rossi
1.引言
2.microRNA的克隆
2.1 总RNA提取
2.2 运用flashPAGETM分离体系分离小RNA
2.3 小RNA的多聚腺苷酸化
2.4 多聚腺苷化小RNA的5′末端接头连接
2.5 反转录
2.6 PCr扩增第一条cDNA链
2.7 聚丙烯酰胺凝胶纯化扩增的cDNA
2.8 PCr产物克隆到TOPO-TA载体
3.microRNA的鉴定
4.Northern杂交验证microRNA的体内表达
致谢
参考文献
摘要
MicroRNA是一类19～24个核苷酸的非编码调控性小RNA，通过与靶基因mRNA3′非翻译区（3′UTR）的互补序列相配对，对靶基因的表达起抑制作用。这类RNA在进化上保守，在胚胎发生、细胞分化和增殖方面有重要的调控功能。同时，它们还与某些人类疾病的发生和发展有关。目前预测人类基因组中约有1000个microRNA，它们可能对30%的人类基因转录本起调控作用。由于不同细胞株系中microRNA表达种类的特异性以及表达水平的差异，microRNA表达谱的建立显得十分重要。小RNA克隆是有效鉴定microRNA组织或细胞表达特异性的可靠方法。本章将介绍一种多聚腺苷酰化介导的cDNA克隆方法。该方法能有效鉴定细胞中大多数的小RNA。它既能用于鉴定新的microRNA或siRNA，同时也能用于验证生物信息学所预测的microRNA或siRNA。
8.体外与体内研究microRNA和小干扰RNA甲基化的方法
ZhiyongYang，GiedriusVilkaitis，BinYu，SauliusKlima比auskas，
andXuemeiChen
1.引言
2.重组HEN1蛋白的表达与纯化
2.1 构建表达载体
2.2 带GST标签的hen1蛋白的表达和纯化
2.3 带His标签的hen1蛋白的表达和制备
3.利用重组HEN1蛋白对小RNA甲基转移酶的检测
3.1 通过监测掺入的［14碳］-甲基基团进行甲基转移酶分析
3.2 通过监测掺入的［3氢］-甲基基团进行甲基转移酶分析
3.3 通过监测β-消除进行甲基转移酶分析
4.应用逆相HPLC确定HEN1-催化反应产物中甲基基团的位置
5.免疫沉淀与HEN1活力检测
5.1 35S∷HA-HEN1的构建和植物转化
5.2 HA-HEN1免疫沉淀和酶活性分析
6.microRNA和siRNA体内甲基化状态的分析
7.结束语
致谢
参考文献
摘要
MicroRNA在植物和动物中有着相似的生物合成过程，然而植物中microRNA的加工还存在3′末端碱基的甲基化步骤。催化拟南芥中microRNA甲基化的酶由HEN1基因编码，并为microRNA的体内合成过程所必须。siRNA的体内甲基化过程也依赖于HEN1基因。生物化学研究证明HEN1是在体外对microRNA和siRNA起作用的甲基化酶（甲基转移酶）。HEN1通过识别21～24个核苷酸长的小RNA双链，将S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基基团转移到小RNA双链最后一个碱基的2′羟基上，而双链结构正是类Dicer酶加工产物的特征。本章将介绍在体内和体外条件下测定HEN1蛋白生化活性以及分析体内小RNA甲基化状态的方法。
9.发育过程中小RNA表达谱的分析
ToshiakiWatanabe，YasushiTotoki，HiroyukiSasaki，NaojiroMinami，andHiroshiImai
1.引言
2.低分子量RNA的制备与尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（Urea-PAGE）
2.1 原理
2.2 方法
2.3 材料
2.4 备注
3.小RNA的克隆
3.1 原理
3.2 方法
3.3 材料
3.4 备注
4.小RNA的分类
4.1 方法
5.Northern杂交分析
5.1 原理
5.2 方法
5.3 材料
5.4 备注
参考文献
摘要
大小在20～30个核苷酸之间的小RNA能通过染色质修饰、mRNA降解或者翻译抑制来调控基因的表达。目前已经鉴定了三大类小RNA，即microRNA、小干扰RNA（siRNA）和Piwi相互作用RNA（piRNA）。MicroRNA涉及发育和细胞分化过程，其表达具有受发育过程调节以及组织特异性表达等特征。siRNA主要参与转座子活性的抑制以及病毒感染的防御。piRNA在生殖细胞和干细胞中表达，其作用被认为与抑制反转录转座子的转座有关。本章将介绍小RNA的克隆、注释、分类以及在发育过程中表达谱分析的方法。
10.T细胞发育过程中microRNA介导的基因调控与功能
TinKyMaoandChang-ZhengChen
1.引言
2.T细胞发育过程中microRNA表达特征的分析
2.1 MicroRNA克隆分析
2.2 MicroRNA定量PCr分析
3.构建表达microRNA的逆转录病毒载体
4.T细胞发育过程中microRNA的功能研究
5.功能相关microRNA靶标基因的鉴定和验证
6.材料与试剂
致谢
参考文献
摘要
MicroRNA是动物基因组编码的长度约为22个核苷酸的高丰度调控性RNA。在动物体中，microRNA通过介导mRNA的降解或翻译抑制来行使其多样的生物学功能。本章以T细胞发育为模型，阐明用于解析microRNA控制的转录后基因调控网络的方法和策略，以及它们在T祖细胞分化过程中的作用。此过程包括：在稀少的T祖细胞中鉴定microRNA基因；检测T细胞发育过程中microRNA的表达水平；利用体外试验研究mi-croRNA在T细胞发育过程中的功能；鉴定受microRNA调控的具有相关功能的基因等。
第三部分 MicroRNA与疾病
11.白血病与淋巴瘤microRNA表达异常的研究
GeorgEAdrianCalinandCarloMariACroce
1.各种人类癌症的起始和发展都涉及microRNA表达的改变
2.基因组范围microRNA表达谱的基因芯片检测
2.1 样品收集
2.2 总RNA分离
2.3 MicroRNA芯片的生产和描述
2.4 靶标准备
2.5 芯片杂交
2.6 原始数据分析
2.7 验证microRNA的结果
3.差异表达microRNA靶标的鉴定和验证
3.1 构建有重要生物学意义的可能性靶标的数据库
3.2 序列互补性研究
3.3 荧光素酶活性报告分析
3.4 相关病例中microRNA与mRNA靶标表达的相关性
3.5 在体内鉴定差异表达microRNA的作用
致谢
参考文献
摘要
MicroRNA基因编码小的非编码RNA，参与基因表达调控。microRNA基因的改变可能在多种甚至所有人类癌症的病理生理学中都扮演着重要的角色，癌的起始和发展都涉及microRNA基因的改变。癌细胞中microRNA组（一个基因组中所有的microRNA）改变的主要机制似乎是导致microRNA基因的异常表达，表现为成熟和（或）前体mi-croRNA的表达水平异于正常组织。有报道表明多种癌症中存在microRNA基因的丢失或扩增，microRNA基因表达模式的改变可能影响细胞周期和细胞生存的程序。micro-RNA基因在恶性细胞和正常细胞中的表达存在巨大的差异，原因可能是microRNA基因在基因组中处于癌相关基因区，表观遗传学机制的改变以及参与其加工过程的成员的改变，都会导致microRNA基因的表达发生改变。生殖细胞和体细胞microRNA基因的突变或靶mRNA的多态性也可能是癌的易患性和发展的原因。microRNA表达谱已经用于揭示人类癌症发病机理中microRNA的潜在作用，并且使我们能够鉴定与人类肿瘤的诊断、分期、发展、预后和治疗效果相关的标记物。本章提供了一个流程图，包含micro-RNA芯片制备、数据分析和生物学意义推断的主要步骤。
12.植物中受病原调控的小RNA的发现
SurekhAKatiyar-AgarwalandHailingJin
1.引言
2.基于测序方法发现受病原调控的小RNA
3.基于杂交方法鉴定和验证受病原诱导的小RNA
3.1 病原体感染组织的小RNA提取
3.1.1 GITC法提取总RNA
3.2 小分子RNA的电泳和凝胶转移
3.3 小RNA的杂交和检测
3.3.1 使用末端标记的寡核苷酸探针检测小RNA
3.3.2 使用一种核糖核酸探针检测小RNA
4.结束语
参考文献
摘要
小RNA已成为真核生物基因表达最重要的调控因子之一。研究表明小RNA介导的基因沉默在动植物的病毒防御体系中发挥重要作用（LiandDing，2005；Voinnet，2005；Wangetal．，2006）。这些病毒RNA产生的小干扰RNA（siRNA）起源于宿主基因组外，而我们和其他实验室的研究表明，宿主细胞内源的小RNA对于植物抵御病毒以外的病原体同样发挥重要的作用（Katiyar-Agarwaletal．，2006；Navarroetal．，2006）。本章介绍的方法为在植物中鉴定更多新的病原体调控的小RNA提供了一个机会，这将有助于我们对植物免疫机制的理解。本章介绍的这种强大的高通量方法，基于平行测序和杂交技术，应用于发现和探测病原体调控的小RNA，这里主要比较和讨论提取病原体感染的组织中低分子量RNA的方法和利用Northern杂交检测内源小RNA的策略。
13.病毒microRNA表达与功能分析的实验方案
EvAGottweinandBryanR．Cullen
1.引言
2.microRNA的表达框
3.稳定导入的载体系统
4.实验步骤：利用pNL-SIN-CMV-BLrmicroRNA表达载体构建表达microRNA
的细胞系
5.根据报告基因确定microRNA的活性
6.实验步骤：病毒混合物制备与报告基因检测
7.结束语
致谢
参考文献
摘要
MicroRNA是一类长度在21～23个核苷酸的小RNA，它们在转录后水平下调靶基因的表达。虽然所有的动植物都有内源microRNA表达，但众多的DNA病毒也编码mi-croRNA是新近才发现的，推测它们有可能下调病毒或者宿主蛋白基因的表达。尽管我们已经了解一部分病毒microRNA的功能，但大多数病毒microRNA的功能还是未知的。疱疹病毒在可编码microRNA的病毒中显得较为独特，这是由于在长期的潜伏期或裂解性复制中，疱疹病毒可以广泛地利用所表达的microRNA。病毒microRNA只在病毒感染的细胞中表达，因而被认为是外源的，所以在没有感染病毒的特定细胞中表达病毒microRNA是一个研究其功能的有效手段。本章将对实现和证实病毒microRNA表达的技术进行介绍。
作者索引
主题索引
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