本书以基因工程的研究步骤及实际操作中的需要为主线，共分12章，包括基因工程的基本概念、基因工程基本技术原理、基因克隆的酶学基础、载体、目的基因的克隆、外源基因的原核细胞表达系统、外源基因的真核细胞表达系统、转基因动物、转基因植物、人类疾病的基因治疗和合成生物学等。每章都有内容提要、思考题和参考文献，书后配有考研模拟复习题以利于巩固知识、进一步延伸阅读之用。
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目录
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前言
第1章 绪论 1
1.1 基因工程的基本概念 1
1.2 基因工程的研究内容 2
1.3 基因工程诞生的基础 2
1.3.1 基因工程诞生的理论基础 2
1.3.2 技术上的三大突破 3
1.4 基因工程技术的诞生 3
1.5 基因工程的应用 5
1.5.1 原核细胞基因工程 5
1.5.2 植物基因工程 7
1.5.3 动物基因工程 8
1.5.4 基因治疗 8
1.5.5 理论研究 9
1.6 基因工程的安全性 9
1.7 我国的《基因工程安全管理办法》 11
思考题 12
参考文献 13
第2章 基因工程的基本技术 14
2.1 凝胶电泳技术 14
2.1.1 基本原理 15
2.1.2 琼脂糖凝胶电泳 15
2.1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 17
2.1.4 脉冲场凝胶电泳 18
2.1.5 双向电泳技术 20
2.1.6 凝胶电泳片段的回收与纯化 21
2.2 分子杂交技术 22
2.2.1 分子杂交的原理 22
2.2.2 分子杂交的类型 24
2.3 PCR技术 26
2.3.1 PCR基本原理和反应过程 26
2.3.2 PCR反应的体系及其设计和优化 28
2.3.3 PCR产物的克隆 31
2.3.4 PCR技术的发展及其应用 36
2.4 DNA序列分析 47
2.4.1 Maxam Gibert化学降解法 47
2.4.2 Sanger双脱氧链终止法 49
2.4.3 DNA序列分析的自动化 50
2.4.4 DNA序列的生物信息学分析 52
2.5 基因芯片及数据分析 53
2.5.1 基因芯片概念 54
2.5.2 技术原理 54
2.5.3 基因芯片的制备 54
2.5.4 基因芯片的应用 55
2.6 研究蛋白质与DNA相互作用的主要方法 57
2.6.1 酵母单杂交系统（可延伸双杂交） 57
2.6.2 凝胶阻滞试验（Gel shift） 57
2.6.3 DNase工足迹法 58
2.6.4 噬菌体展示技术 58
思考题 59
参考文献 59
第3章 基因工程的工具酶 61
3.1 限制性内切核酸酶 62
3.1.1 限制性内切核酸酶的发现与种类 62
3.1.2 限制性内切核酸酶的命名 63
3.1.3 Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性 63
3.1.4 影响限制性内切核酸酶活性的因素 66
3.1.5 限制性内切核酸酶酶切DNA的方法 68
3.2 DNA连接酶 68
3.2.1 DNA连接酶的发现 68
3.2.2 DNA连接酶的种类 69
3.2.3 黏性末端DNA片段的连接 69
3.2.4 平末端DNA片段的连接 71
3.2.5 影响连接反应的因素 73
3.3 DNA聚合酶和反转录酶 74
3.3.1 大肠杆菌DNA聚合酶工及其应用 75
3.3.2 E.coli DNA聚合酶工的Klenow大片段酶及其应用 76
3.3.3 T4噬菌体DNA聚合酶 77
3.3.4 T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶 77
3.3.5 反转录酶 78
3.4 修饰酶类 79
3.4.1 末端脱氧核苷酸转移酶 79
3.4.2 T4多核苷酸激酶 79
3.4.3 碱性磷酸酶 79
3.5 其他工具酶 80
3.5.1 S1核酸酶 80
3.5.2 Bal 31核酸酶 81
3.5.3 核酸外切酶 82
3.5.4 RNA酶 83
思考题 84
参考文献 84
第4章 基因工程的克隆载体 85
4.1 质粒载体 86
4.1.1 质粒的一般生物学特性 86
4.1.2 质粒DNA的复制与拷贝数的控制 89
4.1.3 质粒DNA的分离与纯化 91
4.1.4 质粒载体的构建及类型 92
4.1.5 重要的大肠杆菌质粒载体 95
4.1.6 质粒载体的稳定性问题 99
4.2 噬菌体载体 100
4.2.1 噬菌体的一般生物学特性 100
4.2.2 入噬菌体载体 103
4.2.3 单链DNA噬菌体载体 107
4.3 柯斯质粒载体 112
4.3.1 柯斯质粒载体的构建及其特点 112
4.3.2 柯斯克隆 113
4.3.3 柯斯克隆的改良 114
4.4 噬菌粒载体 116
4.4.1 噬菌粒载体的概念 116
4.4.2 pUC118和pUC119噬菌粒载体 117
4.4.3 pBluescript噬菌粒载体 118
4.5 人工染色体克隆载体 119
4.5.1 构建大容量载体的必要性 119
4.5.2 人工染色体的必需成分 120
4.5.3 酵母人工染色体载体 120
4.5.4 细菌人工染色体载体 122
4.5.5 Pl人工染色体 123
4.5.6 人类人工染色体 123
4.5.7 植物人工染色体 124
思考题 124
参考文献 125
第5章 目的基因的获取与改造 126
5.1 DNA的人工合成 126
5.1.1 人工合成DNA的原理 126
5.1.2 人工合成DNA的应用 128
5.2 从基因文库获取目的基因 130
5.2.1 基因组文库的构建与筛选 130
5.2.2 cDNA文库的构建与筛选 136
5.2.3 基因组文库与cDNA文库的区别 140
5.3 PCR技术与目的基因的分离 141
5.3.1 目的基因的直接扩增和克隆 141
5.3.2 目的基因的cDNA的克隆 141
5.4 电子克隆获取目的基因 141
5.4.1 电子克隆的基本原理 142
5.4.2 利用EST数据库进行电子克隆 142
5.4.3 利用基因组数据库进行电子克隆 143
5.4.4 全长cDNA的判断 143
5.5 根据基因差异表达获得目的基因 143
5.5.1 mRNA差异显示技术 143
5.5.2 cDNA代表性差异分析 145
5.5.3 抑制差减杂交技术 145
5.6 目的基因的改造 147
5.6.1 基因突变与人工诱变技术 147
5.6.2 基因走点诱变 149
5.6.3 基因随机突变 151
思考题 153
参考文献 153
第6章 目的基因的导入与重组体的鉴定 155
6.1 重组DNA向原核细胞的导入 155
6.1.1 原核受体细胞的种类及特点 155
6.1.2 转化 156
6.1.3 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 157
6.1.4 重组入噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 160
6.2 重组DNA导入真核细胞 161
6.2.1 真核受体细胞 161
6.2.2 重组DNA分子导入酵母细胞 162
6.2.3 重组DNA分子导入植物细胞 162
6.2.4 重组DNA分子导入哺乳动物细胞 164
6.3 重组体克隆的筛选与鉴定 167
6.3.1 载体遗传标记筛选法 167
6.3.2 依赖于重组子结构特征分析的筛选法 171
6.3.3 核酸分子杂交检测法 172
6.3.4 免疫化学检测法 174
6.3.5 翻译筛选法 175
6.3.6 亚克隆法 176
6.3.7 插入失活法 176
6.3.8 电子显微镜作图检测法 177
6.3.9 转录产物作图 177
6.3.10 基因表达产物分析法 177
6.3.11 DNA序列测定法 178
思考题 179
参考文献 179
第7章 外源基因的原核表达系统 180
7.1 原核表达系统的特点 180
7.1.1 原核生物的转录 180
7.1.2 原核生物的翻译 181
7.2 原核细胞表达体系 182
7.2.1 大肠杆菌表达体系 182
7.2.2 芽孢杆菌表达体系 185
7.2.3 链霉菌表达体系 186
7.2.4 蓝藻表达体系 188
7.3 提高外源基因表达水平的措施 190
7.3.1 优化表达载体的设计 190
7.3.2 避免使用稀有密码子 190
7.3.3 提高外源基因mRNA的稳定性 190
7.3.4 提高表达蛋白的稳定性，防止其降解 191
7.3.5 减轻细脆的代谢负荷，提高外源基因的表达水平 191
7.3.6 优化发酵条件 191
7.4 利用原核细胞生产真核蛋白质的实例 191
7.4.1 干扰素基因工程 191
7.4.2 生长激素基因工程 192
7.4.3 生长激素释放抑制因子基因工程 193
7.4.4 胰岛素基因工程 194
7.4.5 α-淀粉酶基因工程 195
7.5 目的蛋白的纯化 197
7.5.1 组氨酸标签 197
7.5.2 GST 标签 198
7.5.3 MBP标签 199
7.5.4 IMPACT 199
7.5.5 TAP 标签 200
思考题 201
参考文献 20l
第8章 外源基因的真核表达系统 202
8.1 真核细胞表达体系的特点 202
8.1.1 利用真核细胞作宿主系统的优点 202
8.2 酵母表达系统 203
8.2.1 酵母基因表达载体的构成 203
8.2.2 酵母基因表达载体的种类 204
8.2.3 酵母基因表达系统宿主菌 207
8.2.4 在酵母中高效表达外源基因的策略 207
8.3 昆虫或昆虫细胞表达体系 208
8.3.1 以重组杆状病毒为载体的昆虫表达体系 209
8.3.2 杆状病毒表达系统的效率与加工能力 209
8.3.3 一类稳定转化的昆虫表达系统 211
8.4 哺乳动物细胞基因表达系统 212
8.4.1 哺乳动物基因表达载体的组成特征 213
8.4.2 哺乳动物基因表达载体 214
8.4.3 哺乳动物基因表达宿主细胞 220
8.4.4 提高哺乳动物基因表达系统表达效率的因素 221
思考题 221
参考文献 222
第9章 转基因动物 223
9.1 转基因动物发展简史 223
9.2 转基因动物技术 225
9.2.1 外源基因导入动物细胞的方法 225
9.2.2 转基因动物技术的新发展 234
9.3 转基因动物的制备和检测 240
9.3.1 以显微注射小鼠为例介绍转基因动物的制备 240
9.3.2 转基因的鉴定和表达水平检测 241
9.4 转基因动物研究中出现的问题及其对策 243
9.4.1 转基因动物效率极低 243
9.4.2 难以控制转基因在寄主基因组的行为 244
9.4.3 大部分转基因表达水平极低 244
9.4.4 转基因表达特征及提高转基因表达的策略 245
9.5 转基因动物的应用 246
9.5.1 在生产和生活中的应用 246
9.5.2 在生物制药方面的应用——动物生物反应器 247
9.5.3 在疾病研究中的应用 249
9.5.4 在基础研究中的应用 250
9.6 转基因动物的安全性及其未来 250
9.6.1 食品安全性 251
9.6.2 环境安全性 25l
思考题 252
参考文献 252
第10章 转基因植物 254
10.1 转基因植物概述 254
10.2 转基因植物的基因转化方法 255
10.2.1 转基因植物受体系统 255
10.2.2 农杆菌介导的植物基因转化技术 256
10.2.3 DNA直接导入的基因转化技术 262
10.2.4 花粉管通道法介导的基因转化技术 264
10.3 转基因植物的检测方法 265
10.3.1 基于报告基因/选择标记基因的转基因植物检测方法 265
10.3.2 基于报告基因的转基因植物的外源基因表达检测 266
10.3.3 外源目的基因整合的鉴定 267
10.4 抗虫转基因植物 268
10.4.1 来源于微生物的抗虫基因 268
10.4.2 来源于植物的抗虫基因的应用 270
10.5 抗细菌转基因作物 272
10.5.1 裂解细菌细胞壁 272
10.5.2 破坏细菌细胞膜 273
10.5.3 解除细菌毒素的毒性作用 274
10.5.4 引入对细菌毒素不敏感的靶酶 274
10.5.5 增强植物本身的防卫蛋白合成 274
10.6 抗病毒转基因作物 275
10.6.1 利用非病毒来源的抗病毒基因策略 275
10.6.2 利用病毒来源基因的抗病毒策略 276
10.7 抗除草剂转基因作物 279
10.7.1 增加靶标酶或靶标蛋白的拷贝数 279
10.7.2 作用靶标酶的修饰 279
10.7.3 分离能解除除草剂毒性的酶基因 280
10.7.4 新型除草剂的发展方向 280
10.8 抗逆境转基因作物 280
10.8.1 抗干旱胁迫策略 280
10.8.2 抗寒冻胁迫策略 281
10.8.3 抗盐碱胁迫策略 282
10.9 植物生物反应器 282
10.9.1 植物生物反应器的优点 282
10.9.2 植物生物反应器的研究现状 283
10.9.3 植物生物反应器存在的问题 283
10.10 转基因沉默的原因及对策 284
10.10.1 转基因沉默的原因 284
10.10.2 控制转基因沉默的策略 285
10.11 转基因植物的安全性评价 285
10.11.1 转基因植物食品的安全性评价 286
10.11.2 转基因植物生态环境的安全性评价 288
思考题 290
参考文献 290
第11章 基因治疗 291
11.1 基因治疗的基本概念 291
11.2 基因治疗的发展简史与现状 291
11.3 基因治疗的策略 294
11.3.1 根据基因导入体内的方式 294
11.3.2 根据导入基因发生作用的方式 295
11.4 基因治疗的流程 295
11.4.1 目的基因的准备 295
11.4.2 靶细胞 295
11.4.3 载体的选择 295
11.4.4 转移技术 296
11.5 基因治疗的应用 304
11.5.1 肿瘤的基因治疗 305
11.5.2 单基因病的基因治疗 312
11.5.3 艾滋病等感染性疾病的基因治疗 315
11.6 基因治疗的前景 316
11.6.1 基因治疗面临的问题和挑战 316
11.6.2 基因治疗的发展方向 317
思考题 317
参考文献 317
第12章 合成生物学与基因工程 319
12.1 合成生物学 319
12.1.1 合成生物学的定义 319
12.1.2 合成生物学的研究内容 320
12.1.3 合成生物学的工程本质 325
12.1.4 合成生物学的意义 327
12.1.5 合成生物学的应用 328
12.2 合成生物学与基因工程 331
12.2.1 合成生物学与基因工程的差异 332
12.2.2 合成生物学与基因工程相似之处 333
思考题 334
参考文献 334
附录 总复习题 335
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