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本书是《最新蛋白质科学实验指南》（Current Protocols in Protein Science；CPPS）一书的精编版本，内容全部取材于该书和每季度更新的服务手册，其详细提供了多种实验方案，并包含实验材料、步骤和每种技术的参考文献等信息，可使有经验的研究人员将其作为独立的实验室指南来使用。
　　由于蛋白质具有多样性，其分析也必须包括很广范的结构和理化方法，因此每个研究人员都必须尽可能多地掌握最新方法和传统方法。本指南中既包括特定的详细方案，也包括使方法适应于头特定项目的策略，相信能够有助于读者进一步深入进行蛋白质科学和相关领域的研究。

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  推荐的背景读物
  第1章 蛋白质纯化和定性的策略 1
  1.1单元 蛋白质纯化和定性概述 1
  目标和研究对象 1
  蛋自质纯化的原料 2
  蛋白质的检测和分析 3
  蛋白质分离和纯化方法 3
  蛋白质产物的定性 4
  蛋白质纯化实验室 5
  1.2单元 蛋白质纯化流程图 6
  可榕性重组蛋白 6
  不可溶性重组蛋白 7
  可溶性非重组蛋白 8
  膜相关的和不可溶性重组蛋白 10
  第2章 计算分析 12
  2.1单元 用于蛋白质序列分析的疏水分布图 12
  方法学 13
  应用 14
  结论 16
  2.2单元 蛋白质二级结构预测 17
  二级结构预测的方法 17
  二级结构预测方法的应用 20
  2.3单元 使用BLAST 程序家族进行序列相似性搜索 22
  进入BLAST程序和文档 22
  BLAST介绍 22
  BLAST程序 24
  2.4单元 因特网上的蛋白质数据库 27
  蛋白质结构数据库 28
  蛋白质家族数据库 29
  2.5单元 蛋白质三级结构预测 30
  同源性建模 31
  序列分布图法 32
  线程法 33
  从头结构预测 33
  2.6单元 蛋白质三级结构建模 34
  词汇 34
  进入Swiss Model程序和文档 34
  ExPDB数据库 35
  创建首次法建模查询的格式 35
  观看Swiss Model结果 36
  2.7单元 比较蛋白质结构预测 36
  比较建模的步骤 36
  第3章 检测和分析方法41
  3.1单元 分光光度法确定蛋白质浓度 42
  基本方案1 计算一个蛋白质的摩尔吸收系数 42
  基本方案2 折叠蛋白质摩尔吸收系数的测定 42
  基本方案3 使用摩尔吸收系勤匾过吸收光谱测定蛋白质的浓度 43
  基本方案4 通过205nm处的吸收光谱测定蛋白质的浓度 43
  基本方案5 粗蛋白质提取霞总蛋白质浓度的测定 44
  3.2单元 定量氨基酸分析45
  样品制备 45
  平均组成的讨算 45
  3.3单元 肤和蛋白质的体外放射标记 47
  基本方案1 使用腆珠对醋氨酸或组氨酸残基进行腆化 47
  备择方案1 用氯胶T或Iodog锢在酷氨酸或组氯酸残基腆化 49
  备择方案2 使用乳酸过氧化物酶在氨酸或组氨酸残基腆化 49
  辅助方案1 等摩尔腆化以获得产物的高收率 50
  辅助方案2 用HPLC从模化产物中分离未标记的肤 50
  基本方案2 用Bolton-Hunter试剂在赖氨酸残基或N 端腆化 51
  基本方案3 通过酸酣乙酷化在赖氨酸残基或N端进行14C或3H标记 52
  备择方案3 通过还原性展基化在赖氨酸残基或N端进行14C或3H标记 53
  备择方案4 用腆乙酸或腆乙酷股在赖氨酸残基进行14C或3H标记 54
  基本方案4 在肤合成过程中引人麟己的氨基酸残基 54
  备择方案5 在肤合成过程中在N端进行选择性标记 55
  3.4单元 总蛋白质的分析 56
  基本方案1 总蛋白质定量的双缩分析 57
  基本方案2 总蛋白质定量的Hartree- Lowry分析 57
  基本方案3 总蛋白质定量的二喹啉甲酸（BCA）分析 58
  基本方案4 总蛋白质定量的酸消化一一茚三酮法 58
  辅助方案1 热封玻璃管 59
  基本方案5 测量总蛋白质的考马斯染料结合分析（Bradford 分析） 60
  辅助方案2 蛋白质样品的提肢透析 60
  辅助方案3 蛋白质样品的主氯醋酸沉淀 61
  3.5单元 溶液中和细胞表面上蛋白质的生物素化 62
  基本方案l 将生物素共价连接到赖氨酸上 62
  基本方案2 将生物素共价连接到魏基上63
  辅助方案1 二硫键的还原 64
  辅助方案2 生物素化蛋自质的检测 64
  3.6单元 用氨基酸进行代谢标记 65
  基本方案用[35S]甲硫氨酸对悬浮细胞进行脉冲标记 65
  备择方案1 用[35S]甲硫氨酸对贴壁细胞进行脉冲据记 66
  备择方案2 用[35S]甲梳氨酸对细胞进行脉冲追踪标记 67
  备择方案3 用[35S]甲硫氨酸对细胞进行长期标记 67
  辅助方案用TCA 沉淀确定标记掺入 67
  第4章 提取、稳定和浓缩 69
  4.1单元 用透析和超滤法脱盐、浓缩和更换缓冲液 69
  基本方案1 用再生纤维素透析袋进行脱盐、浓缩和更换缓冲液 69
  基本方案2 用不对称圆盘膜超撞进行浓缩或透析 71
  备择方案1 用切向流超掉进行渗谴或浓缩 73
  备择方案2 用离心式超滤器进行微量浓缩和脱盐 74
  4.2单元 蛋白质的选择性沉淀 75
  策略设计 75
  基本方案l 用盐析选择性沉淀 76
  备择方案1 用分步盐析选择性沉淀 78
  基本方案2 用等离子沉淀选择性沉淀：柱法 78
  备择方案2 用等离子沉淀选择性沉淀：透析法 80
  基本方案3 使用G4和C5有机共溶剂选择性沉淀 80
  基本方案4 使用蛋白质排阻和拥挤剂及渗透物选择性沉淀 81
  基本方案5 使用合成的和半合成的聚合电解质选择性沉淀 82
  基本方案6 使用金属和多盼杂多阴离子选择性沉淀 83
  4.3单元 蛋白质的长期保存 84
  蛋白质聚集 84
  化学阵解 85
  在不冻的水溶液中保存 85
  以盐析沉淀物的形式保存 86
  以冻结溶液的形式保存 86
  以冻干固体的形式保存 87
  选择适当的保存方法 89
  蛋自酶的抑制 89
  第5章 重组蛋白的生产 90
  5.1单元 在大肠杆菌中生产重组蛋自 91
  5.2单元 大肠杆菌表达系统的选择 92
  基本方案l 在PL启动于控制下的表达：温度诱导 94
  基本方案2 在trp启动子控制下的表达：化学诱导 94
  备择方案1 在lac/tac配启动子控制下的表达 95
  备择方案2 T7 RNA聚合酶/启动于表达系统 95
  辅助方案1 菌株保存 96
  辅助方案2 SDS-PAGE分析样品的制备 96
  辅助方案3 可溶性分析 97
  辅助方案4 周质提取物的制备 97
  辅助方案5 细胞外培养基样品的制备 98
  5.3单元 最适宜于蛋白质生产的大肠杆菌的发酵和生长 99
  基本方案以分批发酵的方式生产重组蛋白 99
  备择方案1 用重金属衍生物进行重组蛋白的体内标记 101
  备择方案2 重组蛋白的稳定同位素标记 102
  辅助方案1 监测生长 103
  辅助方案2 检查元菌度 103
  5.4单元 在杆状病毒系统中的蛋白质表达 103
  基本方案1 病毒贮液的大规模生产 104
  基本方案2 表达动力学的确定 105
  基本方案3 在生物反应器中生产 106
  备择方案 用灌注培养生产 107
  辅助方案 收获 108
  5.5单元 用于生产外源蛋白质的酵母培养 108
  基本方案1 使用酿酒酵母半乳静调控的载体小规模表达 109
  备择方案l 使用葡萄糖阻抑型ADH2 载体表达 110
  备择方案2 使用带糖酵解基因启动子的载体表达 110
  基本方案2 在巴斯德毕赤酵母中小规模表达 111
  辅助方案 蛋白质提取物的小规模制备 112
  5.6单元 哺乳动物细胞蛋白质表达的概况 113
  5.7单元 在哺乳动物细胞中生产重组蛋白 115
  基本方案1 用碱裂解/回离子交换捕在法纯化质粒 116
  基本方案2 用脂质体转染法转染细胞 117
  基本方案3 用遗传霉素（G418）进行新霉素磷酸转移酶（NPT 11）的选择 118
  辅助方案 对G418背景敏感性的确定 119
  基本方案4 用氨甲蝶岭（MTX）扩增二氢叶酸还原酶（DHFR） 119
  基本方案5 通过多次传代使悬浮细胞适应生产培养基 120
  基本方案6 细胞在大规模转瓶中以分批的方式生长 122
  基本方案7 细胞在大规模分批反应器中的生长 124
  备择方案 在生物反应器中连续培养细胞的生长 125
  基本方案8 从转瓶培养物和大规模反应器中收获分部的产物 126
  基本方案9 从转瓶培养物的大规模反应器中收获与细胞相关的产物 128
  5.8单元 细胞培养物和症病毒贮液的制备 128
  基本方案1 单层细胞的培养 129
  基本方案2 悬浮细胞的培养 130
  基本方案3 症病毒贮液的制备131
  5.9单元 重组症病毒的构建 132
  基本方案1 用症病毒载体转染症病毒感染的细胞 133
  基本方案2 重组病毒噬斑的选择和筛选 136
  基本方案3 噬斑的扩增 138
  5.10单元 细胞蛋白质表达系统的选择 139
  5.11单元 使用Gateway 系统在多种宿主中进行蛋白质表达 143
  第6章 重组蛋白的纯化 147
  6.1单元 在大肠杆菌中生产的重组蛋白的纯化概述 149
  确定溶解度 150
  蛋白质定位 151
  分离可溶性蛋白质 153
  分离不可溶性蛋白质 153
  6.2单元 从大肠杆菌中制备可榕性蛋白质 155
  基本方案 在大脑杆菌中可溶性表达的一种蛋白质：白细胞介素晴的纯化 156
  6.3单元 从大肠杆菌中制备和提取不溶性（包含体）蛋白质 161
  基本方案1 从大肠杆菌中制备和提取不需性（包含体）蛋白质 161
  基本方案2 在盐酸皿存在的情况下进行中压凝肢过滤层析 162
  6.4单元 蛋白质折叠概述 164
  蛋白质是怎样折叠的 164
  怎样折叠蛋白质 166
  6.5单元 大肠杆菌不榕性（包含体）蛋自质的折叠和纯化 170
  基本方案1 牛生长激素的折叠和纯化 170
  基本方案2 人自细胞介素的折叠和纯化 173
  基本方案3 带组氨酸标签蛋白质的折叠和纯化：HIV-l整合酶 174
  6.6单元 GST融合蛋白的表达和纯化 177
  基本方案1 谷眈甘肽S 转移酶融合蛋白的表达 178
  基本方案2 可溶性GST 融合蛋白的亲和层析纯化 179
  备择方案 用亲和层析从包含体中纯化GST 融合蛋白 181
  基本方案3 蛋白酶切割融合蛋白溶液以除去GST 亲和标签 181
  6.7单元 硫氧还蛋白融合蛋白的表达和纯化 182
  基本方案 硫氧还蛋白融合蛋白的构建和表达 182
  辅助方案 硫氧还蛋白融合蛋白的渗透压释放 185
  第7章 重组蛋白的定性 186
  7.1单元 重组蛋白定性概述 188
  7.2单元 用紫外吸收光谱法测定重组蛋自的一致性和纯度 190
  基本方案 用近紫外光谱法分析蛋白质 190
  7.3单元 测定重组蛋白的一致性和结构 194
  基本方案 测定重组蛋自的二硫键模式 194
  7.4单元 横向尿素梯度电泳 197
  基本方案 197
  7.5单元 分析型超速离心 200
  7.6单元 测定蛋白质的圆二色谱 201
  基本方案 记录CD谱 203
  辅助方案 远紫外CD谱的解释 205
  7.7单元 测定蛋白质的荧光光谱法 205
  基本方案 记录荧光发射光谱 207
  7.8单元 用差示扫描量热法测量蛋白质的热稳定性 209
  基本方案 差示扫描量热法 209
  辅助方案1 电校准 211
  辅助方案2 用碳氢化合物肢囊进行温度校准 211
  辅助方案3 用脂悬液进行温度校准211
  辅助方案4 DSC 比色杯的维护和清洁 211
  7.9单元 用HPLC 凝肢过滤和质谱法对蛋白质进行定性 212
  策略设计 212
  基本方案 重组蛋白的HPLC分析 214
  辅助方案 重组蛋白的MALDI-MS分析 215
  第8章 常规层析分离 217
  8.1单元 常规层析概述 217
  目的蛋白的收率和纯度 217
  纯化策略的步骤 219
  影晌层析分辨率的参数 220
  8.2单元 离子交换层析 224
  策略设计 224
  基本方案1 批量吸附和逐步提高盐浓度的梯度洗脱 227
  备择方案 基于pH 的分步梯度班脱 228
  基本方案2 线性梯度洗脱的柱层析 229
  辅助方案1 用试管预试验确定离子交换层析的起始条件 230
  辅助方案2 离子交换柱动态（柱） 容量和处理容量的测量 232
  辅助方案3 梯度形成技术 232
  辅助方案4 离子交换介质的清洗和再生 233
  辅助方案5 离子交换介质的保存 233
  8.3单元 凝胶过滤层析234
  策略设计 234
  基本方案1 脱盐〈分组分离） 235
  基本方案2 蛋白质分级分离 239
  基本方案3 测定分子大小 239
  备择方案 柱校准 240
  8.4单元 疏水相互作用层析 241
  策略设计 241
  基本方案1 用胶珠的HIC介质装柱 243
  备择方案 用胶珠的HIC介质装柱 244
  基本方案2 测试装填的柱床 244
  基本方案3 从HIC 柱上洗脱蛋白质 246
  辅助方案 HIC 柱的再生、清洁和贮存 246
  8.5单元 肤和蛋白质的HPLC 248
  启动程序 248
  HP-SEC的标准操作条件 253
  HP-NPC的标准操作条件 253
  HP- HIC的标准操作条件 254
  HP-IEX的标准操作条件 254
  HP- HILIC的标准操作条件 255
  HP-IMAC的标准操作条件 256
  HP-BAC的标准操作条件 256
  HPLC的标准操作条件 257
  用RP-HPLC技术对肤和蛋白质混合物进行脱盐处理 259
  RP-HPLC方法的建立 259
  第9章 亲和层析 261
  9.1单元 凝集素亲和层析 263
  基本方案 Con A-Sepharose 亲和层析 263
  辅助方案 确定凝集素结合和洗脱条件的预实验 265
  备择方案 麦胚凝集素（WGA）-Agarose亲和层析 266
  9.2单元 染料亲和层析 266
  基本方案1 用层析法选择各成分 266
  基本方案2 阴性层析 268
  基本方案3 使用分步洗脱的阳性层析 269
  辅助方案 活性染料的固定化 269
  9.3单元 天然配体的亲和纯化 271
  基本方案 CNBr活化 271
  备择方案l 用对硝基苯基氯甲酸醋活化 273
  备择方案2 用2-三氟乙烧基磺酸氯活化 274
  9.4单元 金属整合亲和层析（MCAC） 275
  策略设计 275
  基本方案 用于纯化可溶性带组氨酸尾融合蛋自的非变性MCAC 275
  备择方案1 用于纯化不溶性带组氨酸尾的融合蛋白的变性MCAC 277
  备择方案2 MCAC纯化后蛋白质的固相复性 278
  辅助方案1 纯化后蛋白质的分析和处理 279
  辅助方案2 NTA树脂的再生 279
  9.5单元 免疫亲和层析 280
  基本方案 可溶性或膜结合抗原的分离 280
  备择方案1 抗原的低pH 洗脱282
  备择方案2 抗原的批量纯化 282
  备择方案3 辛基葡萄糖苷的洗脱 283
  辅助方案 抗体-Sepharose的制备 283
  9.6单元 免疫沉淀 284
  基本方案1 用非变性去污剂溶液裂解的细胞悬液进行免疫沉淀 284
  基本方案2 兔疫沉淀一再捕获 289
  第10章 电泳 291
  10.1单元 蛋白质的单向SDS 凝肢电泳 292
  电流和电泳 292
  基本方案 变性（SDS） 不连续聚丙烯酣睡凝肢电掠：Laemmli法 294
  备择方案1 在Tris-Tricine 缓冲液系统中电泳 297
  备择方案2 在梯度凝肢中分离蛋白质 298
  辅助方案灌制多块梯度肢 301
  10.2单元 非变性条件的单向凝胶电泳 303
  基本方案 非变性连续聚丙烯酷脑凝肢电泳 303
  备择方案 非变性不连续电泳和分子质量标准曲线（Ferguson 曲线）的制作 307
  10.3单元 双向凝胶电泳 309
  基本方案1 应用圃相pH 梯度提胶条进行等电聚焦 309
  基本方案2 IPG凝脏的第二向电泳 312
  备择方案 对角线凝肢电抹（非还原/还原凝肢） 313
  10.4单元 利用固定法检测凝胶中的蛋自质 314
  基本方案l 考马斯亮蓝R-250 染色 315
  备择方案1 快速考马斯亮蓝G-250 染色 316
  备择方案2 酸性考马斯亮蓝G-250 染色 317
  基本方案2 SYPRO Ruby 染色 317
  基本方案3 银染 318
  备择方案3 非氨盐银染 319
  备择方案4 快速银染 320
  辅助方案 提肢成像 321
  10.5单元 聚丙烯酷胶凝肢电印迹 322
  基本方案 电印迹到PVDF膜上 322
  备择方案1 用于序列分析的蛋白质电印迹 324
  备择方案2 电印迹至硝酸纤维素膜上 325
  备择方案3 在半干系统中的蛋白质电印迹 325
  10.6单元 检测印迹膜上的蛋白质 327
  基本方案1 氨基黑染色 327
  基本方案2 考马斯亮蓝R-250染色 328
  基本方案3 丽春红S染色 328
  基本方案4 肢体金染色 329
  基本方案5 肢体银染色 329
  基本方案6 印度墨汁染色 330
  基本方案7 荧光腊标记 330
  10.7单元 免疫印迹检测 331
  基本方案 使用直接藕联的第二抗体进行免疫探测 331
  备择方案 用耦联到第二抗体上的抗生物素蛋自一生物素进行免疫探测 332
  辅助方案1 用发色底物显迹 333
  辅助方案2 用发光底物显迹334
  第11章 化学分析 336
  11.1单元 溶液中蛋白质的酶解 336
  基本方案 非变性条件下的蛋白质消化 336
  备择方案1 尿素或盐酸皿禧液中的蛋白质消化339
  备择方案2 SDS溶液中的蛋白质消化 340
  辅助方案1 酶贮液的制备和使用 341
  辅助方案2 消化混合物中肤的还原和S镜基化 344
  11.2单元 在PVDF 膜主酶解蛋白质 345
  基本方案 在氢化Triton X-100冲液中消化结合在PVDF膜上的蛋白质 345
  11.3单元 测序用蛋白质的胶中消化 347
  基本方案 在含Tween 20的胶中消化蛋白质 347
  备择方案1 在含十二烧基磺酸铀的凝肢中消化蛋白质 349
  备择方案2 在不含去污剂的凝肢中消化蛋白质 350
  11.4单元 溶液中蛋白质的化学切割 350
  基本方案l 用澳化氟从甲硫氨酸残基的C 端切割 351
  基本方案2 用BNPS-3 甲基唰噪切割色氨酸残基的C 端 352
  基本方案3 用甲酸切割天冬氨酸脯氨酸肤键 352
  基本方案4 用握腔切割天冬酷腊甘氨酸肤键 353
  基本方案5 用NTCB 切割半眈氨酸残基的N 端 353
  11.5单元 膜上蛋白质的化学切割 354
  基本方案1 用漠化霞切割甲硫氨酸残基的C端 355
  备择方案 用漠化氯切割Edm皿降解法分析过的结合在PVDF膜上的蛋白质 355
  基本方案2 BMPS-3-甲基法切割色氨酸残基的C端 356
  基本方案3 甲酸切割天冬氨酸一脯氨酸肤键 357
  基本方案4 用是腔切割天冬酷腊甘氨酸肤键357
  基本方案5 用NTCB切割半眈氨酸的N 端 357
  11.6单元 反相HPLC分离肤 358
  基本方案1 用反相HPLC分离5-500pmol的肽 358
  基本方案2 用反相HPLC分离5 pmol 的肤 360
  辅助方案毛细管HPLC系统的组装 360
  11.7单元 N端序列分析 362
  仪器使用 362
  样品制备 363
  第12章 翻译后修饰：糖基化 367
  12.1单元 N-糖基化的抑制 367
  基本方案 N-糖基化抑制 367
  辅助方案 丙酮沉淀 371
  12.2单元 N连接寡糖的内切糖昔酶和糖腊酶的释放 372
  基本方案1 内切糖苷酶H消化 372
  基本方案2 肽糖苷酶消化 373
  辅助方案 估测糖蛋白中舟连接寡糖链的数日 374
  基本方案3 唾液酸酶（sialidase 或neuraminidase）消化 374
  12.3单元 蛋白质上糖磷脂锚的检测 375
  基本方案1 用Triton X-114对细胞或膜总蛋白质进行提取和分级分离 375
  备择方案 用Triton X-114对所获蛋白质进行分级分离 376
  基本方案2 通过完整细胞的PI-PLC 消化鉴定GPI 锚定的蛋白质 376
  第13章 翻译后修饰：磷酸化和磷酸酶 378
  13.1单元 用32 Pi标记培养细胞及制备用于免疫沉淀的细胞裂解物 379
  基本方案 用32 Pi标记培养细胞及用温和去污剂裂解 379
  各择方案 在SDS中煮沸裂解细胞 380
  13.2单元 磷酸氨基酸的分析 381
  基本方案 利用酸水解和双向电泳法分析磷酸氨基酸 381
  备择方案 碱处理以增强点在滤膜上的含磷酸化醋氨酸和磷酸化苏氨酸的蛋白质的检测 383
  13.3单元 用免疫学技术检测磷酸化 385
  基本方案 用抗磷酸醋氨酸抗体进行免疫印迹及用C25蛋白A进行检测 385
  备择方案 用增强化学发光（ECL）检测结合的抗体 386
  13.4单元 用酶学技术检测磷酸化 387
  基本方案1 用非特异性酸性磷酸酶消化磷蛋白 388
  备择方案1 用非特异性碱性磷酸酶消化磷蛋白 388
  基本方案2 用蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶消化磷蛋自 389
  备择方案2 用蛋白酶氨酸磷酸酶消化磷蛋自 389
  13.5单元 用透化处理的策略研究蛋白质的磷酸化 390
  基本方案 在透化处理的细胞中分析蛋白质的磷酸化 390
  13.6单元 磷酸肤作图及磷酸化位点的鉴定 392
  基本方 SDS-PAGE分离的蛋白质经膜蛋白酶水解后进行磷酸肽作图 392
  备择方案 固定化蛋白质的水解消化 397
  辅助方案 用于微量序列测定或质谱分析的磷酸肤的制备 398
  第14章 翻译后修饰特定的应用 400
  14.1单元 工硫键形成的分析 400
  基本方案 在完整单层细胞中分析二硫键的形成 401
  备择方案 在悬浮细胞中分析二硫键的形成 402
  14.2单元 蛋白质酷化的分析 402
  基本方案1 用脂肪酸进行生物合成刷己 403
  基本方案2 脂肪酸连接到蛋白质的分析 404
  基本方案3 细胞提取物中总蛋白质结合的脂肪酸标记的分析 404
  基本方案4 脂肪酸标记一致性的分析 406
  14.3单元 蛋白质异戊烯化和竣甲基化的分析 406
  基本方案1 培养细胞中蛋白质的异戊烯化 406
  基本方案2 培养细胞中蛋白质的接甲基化 407
  14.4单元 蛋白质氧化修饰的分析 408
  基本方案1 用2 4-硝基苯脐对蛋白质嵌基进行分光光皮定量 408
  基本方案2 用氯标记的跚氢化铀定量蛋白质提基衍生物 409
  基本方案3 凝肢电泳分析乙酶的蛋白质疏基 410
  基本方案4 用质谱定量蛋白质的工酶氨酸残基 411
  辅助方案1 酶氨酸标准品的制备 412
  辅助方案2 用竞争性ELISA分析蛋白质结合的硝基酶篝酸 413
  基本方案5 异天冬氨酸形成的酶学分析 414
  14.5单元 蛋白质泛素化的分析 415
  基本方案1 目的蛋白的免疫沉淀及随后的抗Ub免疫印迹 415
  基本方案2 从表达His6-Uh的细胞中亲和纯化泛素化的蛋白质 416
  第15章 蛋白质的化学修饰 419
  15.1单元 半脱氨酸的修饰 420
  策略设计 420
  基本方案1 用烷胺试剂（haloacyl reagent）或N-乙基马来酰亚胺对已知太小和组成的蛋白质进行烷基化 421
  基本方案2 用N-碘乙基-三氟乙酰胺进行烷基化 422
  基本方案3 用丙烯酰胺进行烧基化 423
  基本方案4 二硫化物的空气氧化 423
  辅助方案1 比色法定量游离琉基 423
  辅助方案2 半胱氨酸修饰后的样品脱盐 424
  15.2单元 氨基的修饰 425
  策略设计 428
  基本方案1 周琥珀酰亚胶醋进行酰胺化 429
  基本方案2 异硫氧酸荧光素的加入 429
  基本方案3 琥珀酰化 430
  基本方案4 还原性甲基化 430
  第16章 质谱 432
  16.1单元 肽和蛋白质质谱分析综述 433
  在蛋白质结构分析中为什么质谱是一种必需的工具？ 433
  什么是MS？ 34
  什么是串联质谱？ 434
  MS数据能够定量吗？ 435
  样品制备 436
  质量测定准确性和质量分辨率的基本原理 37
  16.2单元 肽和蛋白质MALDI 质量分析用样品的制备 438
  基本方案1 干滴法 440
  基本方案2 快速蒸发法 440
  辅助方案 HCCA的纯化/重结晶 441
  16.3单元 用于MALD-MS 指纹图蛋白质的凝胶内消化 41
  基本方案 441
  16.4单元 在网上搜索序列数据库：用MS-Fit鉴定蛋白质 442
  基本方案 442
  16.5单元 在网上搜索序列数据库：用MS-Tag鉴定蛋白质 444
  基本方案 444
  16.6单元 使用纳升喷雾连接装置将样品直接导人电喷雾离子化质谱仪中 444
  16.7单元 使用微型毛细管液相色谱将样品直接导人电喷雾离子化质谱仪中 446
  基本方案1 制作集成式LC柱ES针头 446
  基本方案2 装配ES针头 447
  基本方案3 微量ES LC/MS连接总成的安装和使用 448
  16.8单元 用四极杆离子阱质谱和SEQUEST 数据库匹配鉴定蛋白质 449
  基本方案 449
  16.9单元 通过手工解释MS/MS 谱进行从头肽测序 450
  基本方案MS/MS 谱的手工解释 450
  辅助方案1 通过甲基醋化证实新测定的序列 454
  辅助方案2 通过乙酷化证实新测定的序列 454
  第17章 肽的制备和处理 456
  17.1单元 在塑料针上合成多种肽 456
  基本方案肽的多合成针合成 456
  辅助方案1 制备活化的Fmoc保护的氨基酸溶液 460
  辅助方案2 肽的N端乙眈化 460
  辅助方案3 肽的N端生物素化 461
  17.2单元 用于生产识别完整蛋白质的抗体的合成肽 461
  基本方案1 计算机辅助选择适当的抗原肽序列 461
  备择方案1 于工检查以选择合适的肽序列 462
  基本方案2 设计用于搞联到载体蛋白质上的合成肽 463
  备择方案2 设计一种合成的多抗原肽 463
  基本方案3 使用异型双功能交联剂将合成肽耦联到载体蛋自质上 463
  辅助方案l 用Ellman试剂分析祖辈离的琉基 464
  辅助方案2 还原肽中的半胧氨酸基团 466
  备择方案3 使用同型双功能试剂将合成的肽捅联到载体蛋自质上 466
  备择方案4 使用碳二亚肢将合成肽耦联到载体蛋白质上 466
  辅助方案3 肽与载体蛋白质摩尔比率的计算 467
  17.3单元 作为蛋白质模拟物的肽树枝状高分子的合成和应用 468
  基本方案1 MAP系统的直接Bos合成 469
  备择方案 直接Fmoc固相合成MAP系统 472
  辅助方案l 茚三酮试验 474
  辅助方案2 用透析法纯化MAP 系统 474
  辅助方案3 使用高效凝胶过撞层析纯化MAP 475
  基本方案2 未端加到侧链上的cMAP 的直接合成 475
  17.4单元 肽二硫键的形成 477
  基本方案1 用空气氧化促进二硫键的形成 477
  备择方案1 通过在树脂上空气氧化促进二硫键的形成 477
  备择方案2 活性炭/空气介导的分子内二硫化物的形成 478
  基本方案2 通过铁氟化饵氧化形成分子内二硫化物 478
  备择方案3 通过铁氟化梆氧化形成分子间或分子内二硫化物 479
  备择方案4 通过铁氟化梆氧化在树脂上形成二硫化物 479
  基本方案3 在弱酸性pH 条件下用DMSO 氧化 479
  备择方案5 在弱碱性pH 条件下用DMSO 氧化 480
  基本方案4 用氧化还原缰冲液氧化 480
  基本方案5 由固相Ellman 试剂介导的氧化 480
  基本方案6 用腆同时去保护/氧化 482
  备择方案6 用腆在树脂上同时进行S-ACM 去保护/氧化 482
  基本方案7 用Tl（III）同时进行S-ACM 去保护/氧化 483
  备择方案7 用Tl（III）在树脂上同时进行S-ACM去保护/氧化 483
  基本方案8 烷基三氯硅-亚胺氧化 484
  第18章 蛋白质互相作用的鉴定 485
  18.1单元 蛋白质才置自质相互作用的分析 485
  基本概念 485
  平衡参数 86
  动力学参数 487
  18.2单元 用相互作用阱/双杂交系统鉴定相互作用的蛋白质 489
  18.3单元 用基于噬菌体的表达克隆鉴定相互作用的蛋白质 497
  策略设计 497
  18.4单元 用共沉淀法检测蛋白质蛋自质相互作用 498
  基本方案 与蛋白A-Sepharose 或蛋白Sepharose 共沉淀的蛋白质 499
  备择方案 GST 融合蛋白的共沉淀 499
  18.5单元 用酵母双杂交芯片高通量筛选蛋白质-蛋白质相互作用 500
  基本方案l 蛋白质组规模的酵母蛋白质芯片的制备 500
  基本方案2 用酵母蛋白质芯片对蛋白质相互作用进行手工筛选 502
  18.6单元 用far Western 分析鉴定蛋白质的相互作用 503
  基本方案蛋白质混合物的far Western 分析 504
  备择方案1 用免疫印迹检测相互作用的蛋白质 505
  备择方案2 在far Western 印迹中用肽鉴定特异性的相互作用序列 505
  18.7单元 用于研究生物分子相互作用的闪烁邻近分析法（SPA） 506
  第19章 蛋白质相E作用的定量 509
  19.1单元 蛋白质相互作用定量的概述 509
  表面等离子共振 510
  分析型超速离心（沉降平衡和沉降速度） 513
  19.2单元 滴定量热法（titration calorimetry） 513
  基本方案1 用恒温滴定微量量热法确定摩尔比率、观察的亲和力（KJb）和观察的结合熔的变化 514
  基本方案2 用ITC 确定生物化学结合热力学 518
  19.3单元 用于测量蛋白质缔合平衡的缩比大区带分析塑凝胶过滤层析 519
  基本方案缩比大区带分析型凝脏过滤层析 519
  辅助方案1 数据分析 521
  辅助方案2 蛋白质装配过程的动量学和化学计量的确定 522
  单体二聚体平衡缔合测量数据的调整 523
  19.4单元 带在线式光散射的分子排阻层析 523
  基本方案1 使用折射率和光散射材算不含碳水化合物蛋白质的分子质量和自缔合程度（双检测器法） 523
  备择方案1 合用光散射检测器和紫外检测器来计算非糖斟k蛋白质的分子质量（双检测器法） 524
  备择方案2 用于大蛋白质的分子排阻层析和光散射：DEBYE 分析 525
  备择方案3 绝对分子质量校准法 525
  基本方案2 使用光散射和反射率计算不含碳水化合物的蛋白质-蛋白质复合物的化学计量 525
  备择方案4 使用光散射和紫外讨辞糖蛋白的蛋白质蛋白质相互作用的化学计量 526
  第20章 肽酶 527
  20.1单元 蛋白酶 527
  蛋自酶的生物学重要性 527
  蛋白酶的命名法 528
  可有效地细分许多蛋白酶的3种方式 528
  20.2单元 酿酒酵母蛋白酶体的纯化和定性 537
  基本方案1 用阴离子交换层析和凝肢过滤纯化酵母26S蛋白酶体 537
  备择方案 用亲和层析纯化酵母26S 蛋白酶体 538
  基本方案2 用常规层析纯化酵母20S 蛋白酶体 539
  辅助方案1 26S 和20S 蛋自酶体肽酶活性的分析 540
  辅助方案2 多聚泛素化溶菌酶的制备 540
  辅助方案3 放射性标记酶蛋白的制备 543
  辅助方案4 用26S 蛋自酶体降解蛋自质底物 543
  辅助方案5 蛋白酶体的非变性提肢电泳/胶内肽酶分析 543
  20.3单元 真核生物20S 蛋白酶体的纯化 544
  基本方案从牛脑垂体纯化20S 蛋白酶体 544
  辅助方案分析蛋白酶体催化的切割的酶分析法 547
  20.4单元 丝氨酸蛋白酶抑制剂 548
  基本方案l 用柱层析纯化人抗凝血酶 548
  辅助方案洗脱组分中抗凝血酶的分析 550
  基本方案2 在无糖胶囊糖存在的情况下分析抗凝血酶抑制一一“递增的抗凝血酶活性” 550
  基本方案3 在糖腊聚糖存在的情况下分析抗凝血酶抑制一一“肝素辅因子活性” 551
  20.5单元 用GFP 作为报道蛋白分析序列特异性蛋白酶 552
  基本方案 位点特异性蛋白酶的荧光分析 552
  辅助方案 用金属整合层析纯化底物-GFP 融合蛋白 553
  备择方案 位点特异性蛋白酶的荧光共振能量转移分析 554
  20.6单元 活性丝氨酸蛋白酶及其变异体的过表达和从大肠杆菌包含体中的纯化 555
  基本方案1 微小纤溶酶原及其变异体的过表达和从大肠杆菌包含体中的纯化 555
  基本方案2 微小纤榕酶原的激活及具有催化活性微小纤溶酶的纯化 557
  辅助方案l 确定重组微小纤溶酶活性的分析方法 557
  辅助方案2 确定活性位点浓度的分析方法 558
  20.7单元 在细胞环境中分析蛋白酶 559
  基本方案1 用细胞渗透性肽底物原位监测细胞内蛋白酶的话性 559
  基本方案2 通过自溶激活和内源底物蛋白质降解原位监测细胞内蛋白酶活性 560
  基本方案3 监测细胞裂解物反映出的蛋白酶活性水平 561
  基本方案4 原位监测分泌的蛋白酶活性 562
  基本方案5 用酶谱法测量细胞分泌的MMP 活性 563
  20.8单元 caspase 的表达、纯化和定性 564
  基本方案l caspase 在大肠杆菌中的表达 564
  基本方案2 caspase 酶分析 567
  辅助方案l 重组caspase 的滴定 568
  辅助方案2 caspase 底物的制备 568
  第21章 基于提肢的蛋白质组分析 570
  21.1单元 使用双向差异凝肢电泳（2-D DIGE）确定蛋白质谱 570
  基本方案 用花青染料（CyDye DIGE 荧光素〉标记蛋白质用于双向电泳 570
  辅助方案 用于Cy 标记反应的蛋白质的制备 573
  备择方案 用质谱技术鉴定DIGE 腔中的蛋白质 574
  21.2单元 用于蛋白质组分析的激光捕获显微分离技术 575
  基本方案1 激光捕在显微分离技术（LCM） 575
  备择方案LCM 组织切片的免疫标记 576
  辅助方案1 LCM 分析用组织的收集和保存 577
  辅助方案2 使用SYPRO RUBY 染料对LCM 捕获材料中的蛋自质进行定量 578
  基本方案2 使用免疫印迹分析LCM 捕获的材料 578
  基本方案3 SELDI 质谱 579
  附录1 试剂和溶液 582
  附录2 常用的度量制和数据 651
  附录3 常用技术 673
  附录3A 蛋白质折叠剂的使用 673
  附录3B 透析 676
  附录3C 玻璃器具硅烷化 678
  附录3D 使用硫酸镜的蛋白质沉淀 679
  附录3E 琼脂糖凝肢电泳 685
  附录3F 用吸收光谱法进行核酸定量 686
  附录4 试剂和设备供货商 689
  参考文献 734
  索引 748